utilitatea mouse-ului Rosa26 Knock-in

 ce este Rosa 26 knock-in

ce este Rosa 26 knock-in

locusul Rosa26 din genomul mouse-ului este un „port sigur” care permite cercetătorilor să exprime gene de interes. Diferite tehnologii de direcționare a genelor (celule stem embrionare; CRISPR) sunt utilizate pentru a face inserții specifice de ADN la locusul Rosa26. Vor fi discutate motivele pentru care oamenii de știință folosesc Rosa26 și alte beneficii cheie pentru utilizarea acestui tip de model genetic de șoarece.

ce este locusul Rosa26?

la începutul anilor 1990, cercetătorii au izolat Rosa26, oferind oamenilor de știință un loc specific pentru inserarea genelor pentru studiu. Înainte de aceasta, geneticienii au folosit modele transgenice de șoarece pentru a testa ipotezele. Șoarecii transgenici sunt generați prin injectarea ADN-ului plasmidic într-un pronucleus. O limitare a transgenezei este că ADN-ul plasmidic se integrează aleatoriu în genomul șoarecelui.

denumit științific GtROSA26, acest locus se găsește pe cromozomul 6 al șoarecilor. Codifică un ARN neesențial care se reproduce în tot corpul și în fiecare celulă/țesut din corp care îl exprimă. Prin urmare, acest locus oferă un loc util pentru a face inserții genetice și pentru a studia modul în care proteinele au impact asupra întregului corp.

oamenii de știință au creat inițial această linie prin captarea genelor retrovirale cu celule stem embrionare. Oamenii de știință au identificat celulele stem embrionare care conțineau acest lucru ca o copie provirală și le-au injectat în blastociste. Cercetătorii au separat șoarecii care au avut inserția Rosa26 pentru studiul viitor. Nici o celulă nu avea vectorul Gen-Roza Inktsgeo nativ, ceea ce impunea oamenilor de știință să creeze cele necesare de la zero.

înainte de direcționarea genelor, cercetătorii au creat șoareci transgenici. Acest lucru a fost realizat prin injectarea ADN — ului plasmidic — transgenă-în pronucleul de șoarece. Un dezavantaj al acestei metode este că transgena se integrează aleatoriu în genomul șoarecelui. În schimb, direcționarea genelor permite oamenilor de știință fie să „elimine” o genă de interes, fie să facă o inserție — knock-in — la un anumit sit din genomul șoarecelui. Locusul Rosa26 este un loc util pentru inserarea unei gene, locația inserției este cunoscută — nu aleatorie — și permite oamenilor de știință să studieze o genă fără a afecta funcția altor gene.

modelele Knock-in care se utilizează acest locus oferă o mai mare precizie și reproductibilitate a rezultatelor. În mod tradițional, acești șoareci knock-in au fost generați folosind celule stem embrionare de șoarece, iar acest proces a devenit mai eficient odată cu apariția tehnologiei CRISPR. Biocytogen folosește sistemul său proprietar CRISPR / Cas9-Extreme genome Editing (ege XV) pentru a obține rezultate mai rapide prin creșterea recombinării omoloage de 10 până la 20 de ori.

De Ce Se Utilizează Rosa26?

datorită ușurinței sale de a bate în ADN, locusul Rosa26 de pe cromozomul 6 de șoarece este foarte util pentru oamenii de știință. Deoarece acest locus codifică un ARN neesențial și nu o genă care servește unei funcții critice, inserțiile nu au efecte adverse. Natura stabilă a sitului și capacitatea oamenilor de știință de a controla expresia genetică globală sau condiționată fac din modelul mouse-ului Rosa26 un instrument genetic versatil.

linii celulare de studiu

linii celulare de studiu

studiul liniilor celulare

prin adăugarea unei gene reporter la acest locus, cercetătorii pot urmări liniile celulare. Abilitatea de a urmări genele de-a lungul unei linii permite un studiu mai aprofundat al modului în care codul genetic trece și se exprimă de-a lungul generațiilor.

înlocuind reporterul cu o toxină, oamenii de știință pot ablate liniile celulare. Eliminarea genelor este o metodă utilizată pentru a studia modul în care absența anumitor gene va afecta un organism. Un astfel de studiu devine deosebit de util în identificarea funcției genice prin absența acesteia.

studierea expresiei genelor în tot corpul

nivelul ridicat de exprimare a genelor inserate în site-ul Rosa26 îl face de dorit pentru cercetători. Un studiu din 1997 asupra șoarecilor crescuți din celule stem embrionare infectate cu retrovirus Rosa Elixigeo a arătat expresie în fiecare țesut din organism.

analiza Chimera

analiza Chimera este o altă aplicație a mouse-ului Rosa26. Astfel de studii examinează șoarecii din doi zigoți care creează animale cu genotipuri diferite în celulele lor. Unele animale prezintă expresii ale acestor genotipuri diferite în modelul sau celulele lor de blană.

șoarecii Rosa26 exprimă galactozidază în celulele lor. Ca atare, oamenii de știință pot folosi celulele Rosa26 ca alele sălbatice marcate. Încrucișarea acestor celule cu celule mutante marchează acele celule modificate. Acești markeri din Site-ul Rosa26 pot indica diferite genotipuri într-o himeră.

homozigoți de studiu care rezultă din Knock-In

în timp ce șoarecii cu genotipuri combinate se dovedesc utili pentru studiu, șoarecii cu genotipuri singulare de la baterea unei gene la site-ul Rosa26 sunt, de asemenea, benefici. În experimentele care utilizează acest locus, homozigoții produși rămân în viață, deși puțini la număr. Viabilitatea acestor șoareci asigură studiul mai lung al rezultatelor genei adăugate la locația Rosa26.

examinați diferențierea celulelor embrionare

folosind site-ul Rosa26, oamenii de știință au creat linii celulare stabile care includeau protein kinaza a, CA-PKA. Când celulele au supraexprimat PKA, au avut o diferențiere mai mare și o formare vasculară. Cercetătorii au susținut că inserarea genelor țintă la locul Rosa26 le-ar permite să studieze mai bine modul în care celulele embrionare se transformă în celule specifice ale corpului.

examinați efectele genelor asupra bolii

 examinați efectele genelor asupra bolii

examinați efectele genelor asupra bolii

unul dintre motivele pentru care oamenii de știință efectuează studii rosa26 knock-in este de a vedea cum o genă afectează dezvoltarea unei boli. Mai multe boli au suspectat legături genetice, iar adăugarea sau scăderea acestor gene din genom poate determina dacă o genă individuală sau un grup dintre ele joacă roluri în dezvoltarea unor afecțiuni precum diabetul sau Alzheimer. de exemplu, cercetătorii au folosit șoareci rosa26 knock-in pentru a examina modul în care tirozin kinazele receptorului Met (RTK) au afectat debutul sclerozei laterale amiotrofice (ALS). Acest studiu a constatat că creșterea RTK Met la șoareci nu a avut un efect asupra dezvoltării neuronilor motori. Cu toate acestea, a încetinit pierderea neuronilor motori, a întârziat debutul ALS și a extins viața șoarecilor cu ALS.

studierea localizării la diferite specii

un alt aspect util al acestui locus este prezența sa la diferite specii. Deși locusul Rosa26 a fost caracterizat inițial la șoareci, este prezent și la oameni, porci, șobolani, șoareci și iepuri. În 2018, cercetătorii au identificat cu succes situl Rosa26 la bovine. Pentru a demonstra eficacitatea Rosa26 ca port sigur la bovine, cercetătorii au introdus gene în acest locus și au produs o linie celulară pentru utilizare în studii viitoare.

studiul locusului Rosa26 la om

în timp ce studierea inserțiilor de gene la șoareci ar putea ajuta cercetarea genetică umană viitoare, utilizarea Rosa26 la om nu este încă posibilă. Spre deosebire de locația la șoareci, Rosa26 la om este aproape de genele critice. Modificarea genei locusului Rosa26 la om ar putea, prin urmare, să perturbe funcția acestor alte gene. Deoarece impactul adăugării de gene la acest loc la om ar putea avea impacturi necunoscute, Rosa26 poate să nu fie un loc de inserție în siguranță la om. Cu toate acestea, AAVS1 este un locus sigur în genomul uman.

beneficii suplimentare ale șoarecilor Knock-In Rosa26

locusul Rosa26 oferă mai multe beneficii față de alte locații ale genomului, făcându-l o opțiune ideală pentru inserția genei specifice site-ului.

mai puțini șoareci au nevoie de

deoarece oamenii de știință cunosc site-ul specific pentru inserarea genelor, au nevoie de mai puțini șoareci pentru succes. Nevoia de mai puțini șoareci reduce resursele și timpul necesar, permițând studii suplimentare în alte domenii.

rate mai mari de succes

la șoarecii transgenici, ADN-ul este integrat aleatoriu în genom și numărul de copii transgene este variabil. Atunci când vizează locusul Rosa26, oamenii de știință obțin rate mai mari de succes datorită locației cunoscute și predictibilității mai mari a rezultatelor în comparație cu tehnologia transgenă mai veche.

locație stabilă

inserțiile genetice nu pot fi făcute în nicio poziție în genomul șoarecelui, deoarece unele locații codifică proteine cu funcții critice. În schimb, locusul Rosa26 este un port sigur care nu va perturba funcția genelor. Prin urmare, introducerea genelor cu mutații sau reporteri fluorescenți la locusul Rosa26 permite exprimarea noii gene fără interferențe.

reproductibilitatea rezultatelor

numeroși șoareci fondatori (generația F0) sunt produși atunci când este generat un model transgenic. Acești fondatori, totuși, au avut rezultate genetice diferite și au fost aproape imposibil de reprodus. O parte din această problemă se referă la numărul de copii transgene și diferențele loci în fiecare model. Pentru Rosa26, oamenii de știință au un locus distinct care le permite acestora și altor cercetători să reproducă rezultate experimentale.

Gena țintă expresă după diferențierea celulară

 Gena țintă expresă după diferențierea celulară

Gena țintă expresă după diferențierea celulară

în cele din urmă, celulele embrionare se vor diferenția în diferite celule ale corpului care vor forma țesuturile, sângele, organele, oasele și alte părți ale corpului. Când se utilizează site-ul Rosa26 și se introduce o genă țintă, expresia rezultată a genei apare în celule după acest eveniment de diferențiere.

această expresie larg răspândită explică de ce chiar și șoarecii adulți din această metodă de editare a genelor arată încă trăsăturile mutației. Abilitatea genei de a urmări prin diferite modificări celulare o face ideală pentru oamenii de știință care doresc să examineze modul în care celulele se modifică prin viața organismului de la făt la adult.

cum creează oamenii de știință șoareci Rosa26 KI?

inserarea genelor în locusul Rosa26 poate fi realizată fie prin utilizarea celulelor stem embrionare vizate, fie prin sistemul CRISPR/Cas9. O secvență floxată, care conține adesea neomicină, este poziționată în fața unei gene de interes pentru a împiedica transcrierea și exprimarea ulterioară.

pentru exprimarea condiționată, oamenii de știință folosesc sistemul Cre-lox. Trecerea unui șoarece „floxat” condiționat cu un șoarece care exprimă cre recombinază șterge secvențele de ADN găsite în secvența floxată. Fără loxp-3xstop-LoxP în amonte de genă, gena poate fi acum transcrisă. Până când acest deleter Cre elimină funcția de oprire, celula se va comporta normal fără a exprima gena. Folosind această metodă condiționată, oamenii de știință pot controla când genele sunt exprimate în diferite celule sau țesuturi.

de obicei, caseta inserată include și un reporter pentru a urmări expresia genei. În multe studii ale acestui locus, oamenii de știință au folosit lacZ, o genă bacteriană, ca reporter, deoarece, dacă nu este integrată în exoni sau introni, nu produce Expresie. Când i se permite să se exprime, lacZ promovează expresia de galactozidază în fiecare țesut adult.

utilizarea îmbunătățită a tehnologiei CRISPR/Cas9 permite oamenilor de știință să utilizeze, de asemenea, această metodă pentru a bate în gene la site-ul Rosa26. Comparativ cu mijloacele mai vechi de injectare a zigoților, CRISPR a creat rate mai mari de succes. Metodele mai vechi au dat doar 10% până la 20% din mutanții fondatori vii, în timp ce șoarecii produși de CRISPR au avut o rată de succes de 50% cu viabilitate și mutație.

ARN CRISPR (crRNA) și ARN trasor (tracrRNA) se leagă ambele între ele și cu secvența genei țintă. Procesul necesită crRNA pentru a identifica ADN-ul în secvență, în timp ce proteinele Cas9 au nevoie de tracrRNA pentru activitatea lor.

pentru a genera un mouse knock – in prin CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 și un vector de direcționare sunt injectate în zigotul mouse-ului. Cele 2 ARN-uri ghidează nucleaza Cas9 către un anumit sit din genom (de exemplu, Rosa26), iar Cas9 face pauza cu două fire. Celula va repara ADN-ul rupt printr-un proces numit homology-directed repair (HDR). Genele de interes din cadrul unui vector de direcționare devin încorporate sau inserate în locusul Rosa26. Sistemul Ege al Biocytogen accelerează HDR, reducând astfel timpul de ecranare a șoarecilor F0.

pentru a verifica acuratețea rezultatelor, analiza Southern blot oferă principalele mijloace de screening pentru inserții aleatorii. Deoarece vectorul de direcționare poate produce inserții aleatorii în 32% din proiectele CRISPR, analiza Southern blot devine un instrument critic în testarea produselor finite. Cu acest test, poziția și numărul copiei din genă sunt verificate pentru acuratețe.

de ce să folosiți șoareci Rosa26 în cercetarea dvs.?

rosa26 șoareci pentru cercetare

pentru instituțiile de cercetare care utilizează modele genetice de șoarece, fiabilitatea rezultatelor joacă un rol crucial în a decide unde să se aprovizioneze animalele. Verificarea rezultatelor, un record lung de succese și numeroși clienți mulțumiți sunt semne ale unei surse de calitate pentru șoarecii Rosa26 și alte servicii genetice.

Biocytogen poate genera șoareci rosa26 knock-in și knock-in condițional pentru a ajuta cercetătorii să abordeze întrebări științifice. Suntem furnizori de servicii și inovatori. Metoda noastră proprie Ege accelerează HR pentru rezultate mai rapide, fără a sacrifica precizia. Nici o facilitate de bază sau furnizor are acest avantaj.

Biocytogen oferă o garanție de satisfacție de 100%. Pentru mai multe informații despre soluțiile noastre personalizate sau pentru întrebări despre procesul nostru de creare a șoarecilor Rosa26, Contactați-Ne.

distribuie:

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.