O Utilitário de Rosa26 Knock-in Mouse

o que é o rosa 26 knock-in

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O Rosa26 locus no mouse genoma é um “porto seguro”, que permite aos pesquisadores para expressar genes de interesse. Diferentes tecnologias de direcionamento de genes (células-tronco embrionárias; CRISPR) são usadas para fazer inserções específicas de DNA no locus Rosa26. A justificativa para os cientistas usarem Rosa26 e outros benefícios importantes para usar esse tipo de modelo genético de camundongo será discutida.

o que é o Locus Rosa26?No início da década de 1990, os pesquisadores isolaram a Rosa26, dando aos cientistas um local específico para inserir genes para estudar. Antes disso, os geneticistas usavam modelos de camundongos transgênicos para testar hipóteses. Camundongos transgênicos são gerados pela injeção de DNA plasmídeo em um pronúcleo. Uma limitação da transgênese é que o DNA do plasmídeo se integra aleatoriamente ao genoma do camundongo.

cientificamente referido como GtROSA26, este locus é encontrado no cromossomo 6 de camundongos. Ele codifica um RNA não essencial que se replica em todo o corpo e em todas as células/tecidos do corpo que o expressam. Portanto, este locus fornece um lugar útil para fazer inserções de genes e estudar como as proteínas afetam todo o corpo.Os cientistas inicialmente criaram essa linha através da captura de genes retrovirais de células-tronco embrionárias. Os cientistas identificaram células-tronco embrionárias que continham isso como uma cópia proviral e as injetaram em blastocistos. Os pesquisadores separaram os ratos que tiveram a inserção Rosa26 para o estudo futuro. Nenhuma célula tinha o vetor Gen-ROSAßgeo nativamente, o que exigia que os cientistas criassem os necessários do zero.

antes da segmentação genética, os pesquisadores criaram camundongos transgênicos. Isso foi conseguido injetando DNA plasmídeo-transgeno – no pronúcleo do camundongo. Uma desvantagem desse método é que o transgene se integra aleatoriamente ao genoma do mouse. Em contraste, o direcionamento de genes permite que os cientistas “eliminem” um gene de interesse ou façam uma inserção — knock-in — em um local específico no genoma do camundongo. O locus Rosa26 é um local útil para inserir um gene, a localização da inserção é conhecida — não aleatória — e permite que os cientistas estudem um gene sem afetar a função de outros genes.

os modelos Knock-in usando este locus oferecem maior precisão e reprodutibilidade dos resultados. Tradicionalmente, esses camundongos knock-in eram gerados usando células-tronco embrionárias de camundongos, e esse processo se tornou mais eficiente com o advento da tecnologia CRISPR. A Biocytogen usa seu sistema proprietário de edição extrema de genoma (Ege™) baseado em CRISPR/Cas9 para obter resultados mais rápidos, aumentando a recombinação homóloga de 10 a 20 vezes.

Por Que O Rosa26 É Usado?

devido à sua facilidade de bater no DNA, o locus Rosa26 no cromossomo 6 do mouse é muito útil para os cientistas. Como esse locus codifica um RNA não essencial e não um gene que serve a uma função crítica, as inserções não têm efeitos adversos. A natureza estável do local e a capacidade dos cientistas de controlar a expressão gênica global ou condicional tornam o modelo de rato Rosa26 uma ferramenta genética versátil.

Estudo de Célula Linhagens

estudo de linhagens de células

estudo de célula linhagens

adicionando um gene repórter para esse locus, os pesquisadores podem rastrear celular linhagens. A capacidade de seguir genes ao longo de uma linha permite um estudo mais aprofundado de como o código genético passa e se expressa ao longo de gerações.

substituindo o repórter por uma toxina, os cientistas podem diminuir as linhagens celulares. Nocautear genes é um método usado para estudar como a ausência de certos genes afetará um organismo. Tal estudo torna-se especialmente útil na identificação da função gênica por meio de sua ausência.

estudar a expressão gênica em todo o corpo

o alto nível de expressão de genes inseridos no site Rosa26 torna desejável para os pesquisadores. Um estudo de 1997 de camundongos cultivados a partir de células-tronco embrionárias infectadas com retrovírus ROSAßgeo mostrou expressão em todos os tecidos do corpo.

Chimera Analysis

Chimera analysis é outra aplicação do rato Rosa26. Tais estudos examinam camundongos de dois zigotos que criam animais com diferentes genótipos em suas células. Alguns animais mostram expressões desses genótipos diferentes em seu padrão de pele ou células.

os ratos Rosa26 expressam β-galactosidase ao longo de suas células. Como tal, os cientistas podem usar células Rosa26 como alelos selvagens marcados. Cruzar essas células com células mutantes marca essas células alteradas. Esses marcadores do site Rosa26 podem indicar diferentes genótipos dentro de uma quimera.

estudo homozigotos resultantes de Knock-In

enquanto camundongos com genótipos combinados se mostram úteis para estudo, camundongos com genótipos singulares de bater em um gene no local Rosa26 também são benéficos. Em experimentos usando este locus, os homozigotos produzidos permanecem vivos, embora poucos em número. A viabilidade destes ratos assegura o estudo mais longo dos resultados do gene adicionado no lugar Rosa26.

Examine a diferenciação celular embrionária

usando o site Rosa26, os cientistas criaram linhas celulares estáveis que incluíam proteína quinase a, CA-PKA. Quando as células superexpressaram PKA, elas tiveram maior diferenciação e formação vascular. Os pesquisadores postularam que a inserção de genes-alvo no local Rosa26 lhes permitiria estudar melhor como as células embrionárias se transformam em células corporais específicas.

Examinar os Efeitos de Genes em Doenças

examinar os efeitos de genes em doenças

examinar os efeitos de genes em doenças

Uma razão cientistas conduta Rosa26 bater nos estudos é ver como o gene afeta o desenvolvimento de uma doença. Várias doenças têm suspeita de genética links e adicionando ou subtraindo estes genes do genoma pode determinar se um gene individual ou de grupo deles desempenham papéis no desenvolvimento de doenças como a diabetes ou a doença de Alzheimer. Por exemplo, os pesquisadores usaram Rosa26 ratinhos knock-in para examinar a forma como Conheceu dos receptores da tirosina-cinases (RTK) afetado o aparecimento da esclerose lateral amiotrófica (ALS). Esse estudo descobriu que aumentar o Met RTK em camundongos não teve efeito no desenvolvimento de neurônios motores. No entanto, diminuiu a perda de neurônios motores, atrasou o início da ELA e prolongou a vida de camundongos com ela.

estudando a localização em várias espécies

outro aspecto útil deste locus é a sua presença em diferentes espécies. Embora o locus Rosa26 tenha sido originalmente caracterizado em camundongos, ele também está presente em humanos, porcos, ratos, camundongos e coelhos. Em 2018, os pesquisadores identificaram com sucesso o site Rosa26 em bovinos. Para comprovar a eficácia do Rosa26 como porto seguro em bovinos, os pesquisadores inseriram genes nesse locus e produziram uma linhagem celular para uso em estudos futuros.

estudo do Locus Rosa26 em humanos

enquanto estudava inserções de genes em camundongos poderia ajudar futuras pesquisas em genética humana, o uso de Rosa26 em humanos ainda não é possível. Ao contrário da localização em camundongos, o Rosa26 em humanos está próximo de genes críticos. A edição genética do locus Rosa26 em humanos poderia, portanto, interromper a função desses outros genes. Como o impacto da adição de genes neste local em humanos pode ter impactos desconhecidos, o Rosa26 pode não ser um local de inserção de porto seguro em humanos. No entanto, AAVS1 é um locus de porto seguro no genoma humano.

benefícios adicionais de camundongos Knock-In Rosa26

o locus Rosa26 oferece vários benefícios em relação a outros locais do genoma, tornando-o uma opção ideal para inserção de genes específicos do local.

menos ratos necessários

porque os cientistas conhecem o local específico para inserir genes, eles exigem menos ratos para o sucesso. A necessidade de menos ratos reduz os recursos e o tempo necessários, permitindo estudos adicionais em outras áreas.

maiores taxas de sucesso

em camundongos transgênicos, o DNA é aleatoriamente integrado ao genoma e o número de cópia transgene é variável. Ao direcionar o locus Rosa26, os cientistas alcançam taxas mais altas de sucesso devido à localização conhecida e maior previsibilidade dos resultados em comparação com a tecnologia transgene mais antiga.

localização estável

as inserções genéticas não podem ser feitas em nenhuma posição no genoma do camundongo, pois alguns locais codificam proteínas com funções críticas. Em contraste, o locus Rosa26 é um porto seguro que não interromperá a função do gene. Portanto, inserir genes com mutações ou repórteres fluorescentes no locus Rosa26 permite que o novo gene seja expresso sem interferência.

reprodutibilidade dos resultados

numerosos ratos fundadores (geração F0) são produzidos quando um modelo transgênico é gerado. Esses fundadores, no entanto, tiveram resultados genéticos diferentes e eram quase impossíveis de reproduzir. Parte desta edição refere-se ao número de cópia transgene e diferenças loci em cada modelo. Para Rosa26, os cientistas têm um locus distinto que permite que eles e outros pesquisadores reproduzam resultados experimentais.

Express Gene Alvo Após a Diferenciação Celular

Express Gene Alvo Após a Diferenciação Celular

Express Gene Alvo Após a Diferenciação Celular

Eventualmente, células embrionárias irá se diferenciar em várias células do corpo que formarão os tecidos, sangue, órgãos, ossos e outras partes do corpo. Ao usar o site Rosa26 e inserir um gene alvo, a expressão resultante do gene aparece nas células após esse evento de diferenciação.

esta expressão generalizada explica por que mesmo os ratos adultos deste método de edição de genes ainda mostram os traços da mutação. A capacidade do gene de rastrear várias mudanças celulares o torna ideal para cientistas que procuram examinar como as células se alteram ao longo da vida do organismo, do feto ao adulto.

como os cientistas criam ratos ROSA26 KI?

a inserção de genes no locus Rosa26 pode ser realizada usando células-tronco embrionárias direcionadas ou através do sistema CRISPR/Cas9. Uma sequência floxeada, que geralmente contém neomicina, é posicionada na frente de um gene de interesse para evitar que ele transcreva e subsequentemente se expresse.

para expressão condicional, os cientistas empregam o sistema Cre-lox. Cruzando um rato condicional “floxed” com um rato expressando recombinase Cre exclui sequências de DNA encontradas dentro da sequência floxed. Sem o loxp-3xstop-LoxP a montante do gene, o gene pode agora ser transcrito. Até que este CRE deleter remova a função stop, a célula se comportará normalmente sem expressar o gene. Usando este método de knock-in condicional, os cientistas podem controlar quando os genes são expressos em diferentes células ou tecidos.

Normalmente, o cassete inserido também inclui um repórter para rastrear a expressão do gene. Em muitos estudos desse locus, os cientistas usaram lacZ, um gene bacteriano, como repórter porque, a menos que integrado a exons ou introns, ele não produz expressão. Quando permitido se expressar, o lacZ promove a expressão Da β-galactosidase em todos os tecidos adultos.

o uso aprimorado da tecnologia CRISPR/Cas9 permite que os cientistas também usem esse método para bater em genes no local do Rosa26. Em comparação com os meios mais antigos de injetar zigotos, o CRISPR criou taxas mais altas de sucesso. Os métodos mais antigos produziram apenas 10% a 20% dos mutantes fundadores vivos, enquanto os ratos produzidos pela CRISPR tiveram uma taxa de sucesso de 50% com viabilidade e mutação.

o RNA CRISPR (crRNA) e o RNA traçador (tracrRNA) se ligam entre si e com a sequência gênica alvo. O processo requer crRNA para identificar o DNA na sequência, enquanto as proteínas Cas9 precisam de tracrRNA para sua atividade.

para gerar um mouse knock-in através CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 e um vetor de segmentação são injetados no zigoto do mouse. OS 2 RNAs guiam a nuclease Cas9 para um local específico no genoma (por exemplo, Rosa26), e Cas9 faz a quebra de fita dupla. A célula irá reparar o DNA quebrado através de um processo chamado reparo dirigido por homologia (HDR). Genes de interesse dentro de um vetor alvo são incorporados ou inseridos no locus Rosa26. O sistema Ege da Biocytogen acelera o HDR, reduzindo o tempo de exibição dos mouses F0.

para verificar a precisão dos resultados, a análise de Southern blot fornece os principais meios de triagem para inserções aleatórias. Como o vetor de segmentação pode produzir inserções aleatórias em 32% dos projetos CRISPR, a análise do Southern blot se torna uma ferramenta crítica no teste dos produtos acabados. Com este teste, a posição e o número da cópia no gene são verificados quanto à precisão.

por que usar ratos Rosa26 em sua pesquisa?

rosa26 ratos de investigação

Para instituições de pesquisa que use o mouse genética modelos, a fiabilidade dos resultados desempenha um papel crucial na decisão de onde a origem dos animais. Verificação de resultados, um longo registro de sucessos e inúmeros clientes satisfeitos são sinais de uma fonte de qualidade para camundongos Rosa26 e outros serviços genéticos.

Biocytogen pode gerar rosa26 knock-in e condicional knock-in ratos para ajudar os pesquisadores a abordar questões científicas. Somos prestadores de serviços e inovadores. Nosso método proprietário de EGE acelera a hora para resultados mais rápidos sem sacrificar a precisão. Nenhuma instalação central ou fornecedor tem essa vantagem.

a Biocytogen oferece uma garantia de satisfação de 100%. Para obter mais informações sobre nossas soluções personalizadas ou para consultas sobre nosso processo de criação de mouses Rosa26, entre em contato conosco.

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