użyteczność myszy typu Knock-in Rosa26

co to jest rosa 26 knock-in

co to jest rosa 26 knock-in

locus Rosa26 w genomie myszy jest „bezpieczną przystanią”, która pozwala naukowcom na ekspresję interesujących genów. Różne technologie celowania genów (embrionalne komórki macierzyste; CRISPR) są używane do tworzenia specyficznych insercji DNA w locus Rosa26. Omówione zostaną przesłanki zastosowania Rosa26 przez naukowców oraz inne kluczowe korzyści wynikające z zastosowania tego typu mysich modeli genetycznych.

Co To jest Locus Rosa26?

na początku lat 90.naukowcy wyizolowali Rosa26, dając naukowcom specjalne miejsce do wstawiania genów do badań. Wcześniej genetycy wykorzystywali transgeniczne modele myszy do testowania hipotez. Transgeniczne myszy są generowane przez wstrzyknięcie plazmidu DNA do pronucleus. Jednym z ograniczeń transgenezy jest to, że plazmid DNA losowo integruje się z genomu myszy.

naukowo określany jako GtROSA26, ten locus znajduje się na chromosomie 6 myszy. Koduje nieistotny RNA, który replikuje się w całym ciele i każdej komórce / tkance w ciele, która go wyraża. Dlatego to locus stanowi użyteczne miejsce do tworzenia insercji genów i badania wpływu białek na całe ciało.

naukowcy początkowo stworzyli tę linię poprzez retrowirusowe wychwytywanie genów embrionalnych komórek macierzystych. Naukowcy zidentyfikowali embrionalne komórki macierzyste, które zawierały to jako prowiralną kopię i wstrzyknęli je do blastocyst. Naukowcy rozdzielili myszy, które miały wstawienie Rosa26 do przyszłych badań. Żadne komórki nie posiadały wektora genu–ROSAßgeo natywnie, co wymagało od naukowców stworzenia tych potrzebnych od podstaw.

przed ukierunkowaniem genów naukowcy stworzyli transgeniczne myszy. Osiągnięto to poprzez wstrzyknięcie plazmidu DNA-transgenu-do wymowy myszy. Wadą tej metody jest to, że transgen losowo integruje się z genomem myszy. W przeciwieństwie do tego, celowanie genów pozwala naukowcom albo „nokautować” interesujący Gen, albo wprowadzić — knock-in — w określonym miejscu w genomie myszy. Locus Rosa26 jest użytecznym miejscem do wstawienia genu, miejsce wstawienia jest znane-nie przypadkowe-i pozwala naukowcom badać Gen bez wpływu na funkcję innych genów.

modele Knock-in wykorzystujące ten locus oferują większą dokładność i powtarzalność wyników. Tradycyjnie te myszy typu „knock-in” były generowane przy użyciu mysich embrionalnych komórek macierzystych, a proces ten stał się bardziej wydajny wraz z pojawieniem się technologii CRISPR. Biocytogen wykorzystuje swój autorski system CRISPR / Cas9 Extreme Genome Editing (EGE™), aby uzyskać szybsze wyniki poprzez zwiększenie rekombinacji homologicznej 10 do 20 razy.

Dlaczego Używa Się Rosa26?

ze względu na łatwość zapukania w DNA, locus Rosa26 na chromosomie 6 myszy jest bardzo przydatny dla naukowców. Ponieważ to locus koduje nieistotny RNA, a nie gen, który pełni krytyczną funkcję, insercje nie mają negatywnych skutków. Stabilny charakter miejsca i zdolność naukowców do kontrolowania globalnej lub warunkowej ekspresji genów sprawiają, że model myszy Rosa26 jest wszechstronnym narzędziem genetycznym.

Badaj linie komórkowe

 badaj linie komórkowe

badaj linie komórkowe

dodając Gen reporterowy do tego locus, naukowcy mogą śledzić linie komórkowe. Zdolność do śledzenia genów w całej linii pozwala na bardziej dogłębne badanie tego, jak kod genetyczny przechodzi w dół i wyraża się przez pokolenia.

zastępując reportera toksyną, naukowcy mogą ablować linie komórkowe. Wybijanie genów jest jedną z metod stosowanych do badania, w jaki sposób brak niektórych genów wpłynie na organizm. Takie badanie staje się szczególnie przydatne w identyfikacji funkcji genu poprzez jego brak.

badanie ekspresji genów w całym ciele

wysoki poziom ekspresji genów wprowadzanych do witryny Rosa26 sprawia, że jest to pożądane dla badaczy. Badanie przeprowadzone w 1997 roku na myszach wyhodowanych z embrionalnych komórek macierzystych zakażonych retrowirusem ROSAßgeo wykazało ekspresję w każdej tkance ciała.

Analiza Chimery

analiza Chimery to kolejne zastosowanie myszki Rosa26. Takie badania badają myszy z dwóch zygotów, które tworzą zwierzęta o różnych genotypach w swoich komórkach. Niektóre zwierzęta wykazują ekspresję tych różnych genotypów w ich strukturze futra lub komórek.

myszy Rosa26 wykazują ekspresję β-galaktozydazy w swoich komórkach. Jako takie naukowcy mogą używać komórek Rosa26 jako zaznaczonych dzikich alleli. Skrzyżowanie tych komórek z komórkami zmutowanymi oznacza te zmienione komórki. Te markery z miejsca Rosa26 mogą wskazywać na różne genotypy w obrębie Chimery.

Badaj homozygoty wynikające z Knock-In

podczas gdy myszy z połączonymi genotypami okazują się przydatne do badania, myszy z pojedynczymi genotypami z pukania w gen w miejscu Rosa26 są również korzystne. W eksperymentach z użyciem tego locus, homozygoty produkowane pozostają żywe, choć nieliczne. Żywotność tych myszy zapewnia dłuższe badanie wyników dodanego genu w lokalizacji Rosa26.

zbadaj różnicowanie komórek embrionalnych

korzystając ze strony Rosa26, naukowcy stworzyli stabilne linie komórkowe, które obejmowały kinazę białkową a, CA-PKA. Gdy komórki nadekspresowane PKA, miały większe różnicowanie i tworzenie naczyń. Naukowcy zakładali, że wstawienie genów docelowych w miejscu Rosa26 pozwoli im lepiej zbadać, jak komórki embrionalne zmieniają się w określone komórki ciała.

zbadaj wpływ genów na chorobę

 zbadaj wpływ genów na chorobę

zbadaj wpływ genów na chorobę

jednym z powodów, dla których naukowcy przeprowadzają badania typu knock-in Rosa26, jest sprawdzenie, w jaki sposób gen wpływa na rozwój choroby. Kilka choroby podejrzewać genetyczne powiązania, i dodawanie lub odejmowanie te geny od genomu może określić, czy indywidualny gen lub grupa z nich odgrywać rolę w rozwoju warunków, takich jak cukrzyca lub Alzheimer. na przykład, naukowcy wykorzystali rosa26 knock-in myszy zbadać, jak Met receptor kinazy tyrozynowe (RTK) wpływ na początek stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Badanie to wykazało, że zwiększenie RTK Met u myszy nie miało wpływu na rozwój neuronu ruchowego. Jednak spowolniło to utratę neuronów ruchowych, opóźniło początek ALS i wydłużyło życie myszy z ALS.

badanie lokalizacji u różnych gatunków

innym użytecznym aspektem tego locus jest jego obecność u różnych gatunków. Chociaż locus Rosa26 był pierwotnie scharakteryzowany u myszy, jest również obecny u ludzi, świń, szczurów, myszy i królików. W 2018 r. naukowcy z powodzeniem zidentyfikowali stanowisko Rosa26 u bydła. Aby udowodnić skuteczność Rosa26 jako bezpiecznej przystani u bydła, naukowcy wprowadzili geny do tego miejsca i stworzyli linię komórkową do wykorzystania w przyszłych badaniach.

badanie Locus Rosa26 u ludzi

chociaż badanie insercji genów u myszy może pomóc w przyszłych badaniach Genetyki Człowieka, zastosowanie Rosa26 u ludzi nie jest jeszcze możliwe. W przeciwieństwie do lokalizacji u myszy, Rosa26 u ludzi jest blisko krytycznych genów. Edycja genów locus Rosa26 u ludzi może zatem zaburzać funkcjonowanie tych innych genów. Ponieważ wpływ dodawania genów w tym miejscu u ludzi może mieć nieznany wpływ, Rosa26 może nie być bezpiecznym miejscem wstawiania u ludzi. Jednak AAVS1 jest bezpiecznym miejscem schronienia w ludzkim genomie.

dodatkowe korzyści z myszy typu Knock-In Rosa26

locus Rosa26 oferuje kilka korzyści w porównaniu z innymi lokalizacjami w genomie, dzięki czemu jest idealnym rozwiązaniem do wstawiania genów specyficznych dla danego miejsca.

mniej myszy potrzebowało

ponieważ naukowcy znają specyficzne miejsce do wstawiania genów, potrzebują mniej myszy do osiągnięcia sukcesu. Potrzeba mniejszej liczby myszy zmniejsza zasoby i czas potrzebny, umożliwiając dalsze badania w innych obszarach.

wyższe wskaźniki sukcesu

u myszy transgenicznych DNA jest losowo zintegrowane z genomem, a liczba kopii transgenu jest zmienna. Badając locus Rosa26, naukowcy osiągają wyższe wskaźniki sukcesu ze względu na znaną lokalizację i większą przewidywalność wyników w porównaniu ze starszą technologią transgenu.

stabilna lokalizacja

insercje genetyczne nie mogą być wykonane w żadnej pozycji w genomie myszy, ponieważ niektóre lokalizacje kodują białka o krytycznych funkcjach. Natomiast locus Rosa26 jest bezpieczną przystanią, która nie zakłóci funkcji genów. Dlatego wstawienie genów z mutacjami lub fluorescencyjnymi reporterami w locus Rosa26 pozwala na ekspresję nowego genu bez ingerencji.

odtwarzalność wyników

liczne myszy założycielskie (generacja F0) są produkowane, gdy generowany jest model transgeniczny. Ci założyciele mieli jednak różne wyniki genetyczne i byli prawie niemożliwi do odtworzenia. Część tej kwestii dotyczy liczby kopii transgenu i różnic loci w każdym modelu. W przypadku Rosa26 naukowcy mają odrębne locus, które pozwala im i innym badaczom odtworzyć wyniki eksperymentów.

ekspresowy Gen docelowy po różnicowaniu komórek

 ekspresowy Gen docelowy po różnicowaniu komórek

ekspresowy Gen docelowy po różnicowaniu komórek

ostatecznie komórki embrionalne różnicują się w różne komórki ciała, które tworzą tkanki, krew, narządy, kości i inne części ciała. Podczas korzystania z miejsca Rosa26 i wstawiania docelowego genu, wynikowa ekspresja genu pojawia się w komórkach po tym zdarzeniu różnicowania.

to powszechne wyrażenie wyjaśnia, dlaczego nawet dorosłe myszy z tej metody edycji genów nadal wykazują cechy mutacji. Zdolność genu do śledzenia różnych zmian w komórkach czyni go idealnym rozwiązaniem dla naukowców, którzy chcą zbadać, jak komórki zmieniają się przez życie organizmu od płodu do dorosłego.

jak naukowcy tworzą myszy Rosa26 KI?

Wstawianie genów do locus Rosa26 może być realizowane albo za pomocą ukierunkowanych embrionalnych komórek macierzystych, albo za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas9. Sekwencja flokowana, która często zawiera neomycynę, jest umieszczana przed interesującym genem, aby zapobiec jego transkrypcji, a następnie ekspresji.

w przypadku wyrażenia warunkowego naukowcy stosują system Cre-lox. Krzyżowanie warunkowej myszy „flokowanej” z myszą wyrażającą Rekombinazę Kreatynową usuwa sekwencje DNA znajdujące się w sekwencji flokowanej. Bez loxp-3XSTOP-LoxP przed genem, gen może być teraz transkrybowany. Dopóki Cre deleter nie usunie funkcji stop, komórka będzie zachowywać się normalnie bez ekspresji genu. Stosując tę warunkową metodę knock-in, naukowcy mogą kontrolować, kiedy geny są wyrażane w różnych komórkach lub tkankach.

zazwyczaj wkładana kaseta zawiera również reportera do śledzenia ekspresji genu. W wielu badaniach nad tym locus naukowcy wykorzystali lacZ, Gen bakteryjny, jako reportera, ponieważ o ile nie jest zintegrowany z eksonami lub intronami, nie wytwarza ekspresji. Po pozwoleniu na ekspresję lacZ Promuje ekspresję β-galaktozydazy w każdej dorosłej tkance.

ulepszone wykorzystanie technologii CRISPR / Cas9 pozwala naukowcom również na zastosowanie tej metody do wbijania genów w stronę Rosa26. W porównaniu do starszych sposobów wstrzykiwania zygoty, CRISPR stworzył wyższe wskaźniki sukcesu. Starsze metody dawały tylko 10% do 20% żywych mutantów, podczas gdy myszy produkowane przez CRISPR miały 50% wskaźnik powodzenia z żywotnością i mutacją.

CRISPR RNA (crRNA) i TRACER RNA (tracrRNA) wiążą się ze sobą i z sekwencją docelowego genu. Proces wymaga crRNA do identyfikacji DNA w sekwencji, podczas gdy białka Cas9 potrzebują tracrRNA do swojej aktywności.

w celu wygenerowania myszy knock-in przez CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 i Wektor celujący są wstrzykiwane do zygoty myszy. 2 RNA prowadzą nukleazę Cas9 do określonego miejsca w genomie (np. Rosa26), a Cas9 powoduje przerwanie podwójnej nici. Komórka naprawi uszkodzone DNA w procesie zwanym naprawą homologiczną (HDR). Geny będące przedmiotem zainteresowania w obrębie wektora celującego zostają włączone lub wprowadzone do locus Rosa26. System EGE firmy BIOCYTOGEN przyspiesza HDR, skracając tym samym czas wyświetlania myszy F0.

aby zweryfikować dokładność wyników, Analiza Southern blot zapewnia podstawowe środki przesiewowe dla losowych wstawek. Ponieważ wektor celujący może powodować losowe wstawki w 32% projektów CRISPR, Analiza Southern blot staje się krytycznym narzędziem w testowaniu gotowych produktów. Dzięki temu testowi pozycja i numer kopii w genie zostają zweryfikowane pod kątem dokładności.

dlaczego warto używać myszy Rosa26 w swoich badaniach?

rosa26 myszy do badań

w przypadku instytucji badawczych, które wykorzystują mysie modele genetyczne, wiarygodność wyników odgrywa kluczową rolę w podejmowaniu decyzji, gdzie pozyskać zwierzęta. Weryfikacja wyników, długa lista sukcesów i wielu zadowolonych klientów to oznaki wysokiej jakości źródła dla myszy Rosa26 i innych usług genetycznych.

Biocytogen może generować myszy typu knock-in I warunkowego knock-in Rosa26, aby pomóc naukowcom w rozwiązywaniu problemów naukowych. Jesteśmy usługodawcami i innowatorami. Nasza opatentowana metoda EGE przyspiesza HR, zapewniając szybsze wyniki bez utraty dokładności. Żaden główny zakład ani dostawca nie ma tej przewagi.

Biocytogen oferuje 100% gwarancję satysfakcji. Aby uzyskać więcej informacji na temat naszych niestandardowych rozwiązań lub zapytań dotyczących procesu tworzenia myszy Rosa26, skontaktuj się z nami.

podziel się:

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.