nyttan av Rosa26 Knock-in-musen

 vad är rosa 26 knock-in

vad är rosa 26 knock-in

Rosa26 locus i musgenomet är en ”säker hamn” som gör det möjligt för forskare att uttrycka gener av intresse. Olika geninriktningstekniker (embryonala stamceller; CRISPR) används för att göra specifika DNA-Infogningar vid Rosa26-platsen. Motiveringen för forskare att använda Rosa26 och andra viktiga fördelar med att använda denna typ av musgenetisk modell kommer att diskuteras.

Vad är Rosa26 Locus?

i början av 1990-talet isolerade forskare Rosa26, vilket gav forskare en specifik plats för att infoga gener att studera. Före detta använde genetiker transgena musmodeller för att testa hypoteser. Transgena möss genereras genom att injicera plasmid-DNA i en pronukleus. En begränsning av transgenes är att plasmid-DNA slumpmässigt integreras i musgenomet.

vetenskapligt kallad GtROSA26 finns detta locus på kromosom 6 hos möss. Det kodar för ett icke-essentiellt RNA som replikerar i hela kroppen och varje cell/vävnad i kroppen som uttrycker det. Därför ger denna locus en användbar plats för att göra geninsättningar och studera hur proteiner påverkar hela kroppen.

forskare skapade ursprungligen denna linje genom embryonal stamcell retroviral genfångst. Forskare identifierade embryonala stamceller som innehöll detta som en proviral kopia och injicerade dem i blastocyster. Forskare separerade mössen som hade rosa26-införandet för framtida studier. Inga celler hade vektorn Gen-Rosa Occurgeo inbyggt, vilket krävde att forskare skapade de som behövdes från början.

före geninriktning skapade forskare transgena möss. Detta åstadkoms genom att injicera plasmid — DNA — transgen-i muspronukleus. En nackdel med denna metod är att transgenen slumpmässigt integreras i musgenomet. Däremot tillåter geninriktning forskare att antingen ”knockout” en gen av intresse eller göra en insättning — knock-in — på en specifik plats i musgenomet. Rosa26 locus är en användbar plats för att infoga en gen, placeringen av införandet är känd — inte slumpmässig — och det gör det möjligt för forskare att studera en gen utan att påverka funktionen hos andra gener.

Knock-In-modeller som använder denna locus erbjuder större noggrannhet och reproducerbarhet av resultat. Traditionellt genererades dessa knock-in-möss med hjälp av embryonala stamceller från mus, och denna process har blivit effektivare med tillkomsten av CRISPR-teknik. Biocytogen använder sitt proprietära CRISPR / Cas9-baserade Extreme Genome Editing-system (ege aug.) för att få snabbare resultat genom att öka den homologa rekombinationen 10 till 20 gånger.

Varför Används Rosa26?

på grund av sin lätthet att knacka i DNA är Rosa26-locus på muskromosom 6 mycket användbar för forskare. Eftersom detta locus kodar för ett icke-essentiellt RNA och inte en gen som tjänar en kritisk funktion saknar Infogningar negativa effekter. Platsens stabila natur och förmågan för forskare att kontrollera globalt eller villkorligt genuttryck gör Rosa26-musmodellen till ett mångsidigt genetiskt verktyg.

Studiecellslinjer

 studiecellslinjer

studera celllinjer

genom att lägga till en reportergen till denna plats kan forskare spåra celllinjer. Förmågan att följa gener genom en linje möjliggör en mer djupgående studie av hur genetisk kod går ner och uttrycker sig över generationer.

genom att ersätta reportern med ett toxin kan forskare avlägsna celllinjer. Att slå ut gener är en metod som används för att studera hur frånvaron av vissa gener kommer att påverka en organism. En sådan studie blir särskilt användbar för att identifiera genfunktion genom dess frånvaro.

studera genuttryck i hela kroppen

den höga uttrycksnivån för gener som sätts in i Rosa26-platsen gör det önskvärt för forskare. En studie från 1997 av möss som odlats från embryonala stamceller infekterade med rosa Occurgeo retrovirus visade uttryck i varje vävnad i kroppen.

Chimera-analys

Chimera-analys är en annan tillämpning av rosa26-musen. Sådana studier undersöker möss från två zygoter som skapar djur med olika genotyper i sina celler. Vissa djur visar uttryck för de olika genotyperna i deras pälsmönster eller celler.

Rosa26-möss uttrycker Bisexuell-galaktosidas genom sina celler. Som sådan kan forskare använda Rosa26-celler som markerade vilda alleler. Att korsa dessa celler med mutanta celler markerar de förändrade cellerna. Dessa markörer från Rosa26-platsen kan indikera olika genotyper inom en chimera.

Studiehomozygoter som härrör från Knock-in

medan möss med kombinerade genotyper visar sig vara användbara för studier, är möss med singulära genotyper från att knacka i en gen på Rosa26-platsen också fördelaktiga. I experiment som använder denna plats förblir producerade homozygoter levande, men få i antal. Livskraften hos dessa möss säkerställer den längre studien av resultaten av den tillsatta genen på Rosa26-platsen.

Undersök embryonal celldifferentiering

med hjälp av Rosa26-platsen skapade forskare stabila cellinjer som inkluderade proteinkinas A, CA-PKA. När celler överuttryckte PKA hade de större differentiering och vaskulär bildning. Forskarna föreslog att införande av målgener på Rosa26-platsen skulle göra det möjligt för dem att bättre studera hur embryonala celler förändras till specifika kroppsceller.

Undersök effekterna av gener på sjukdom

 undersök effekterna av gener på sjukdom

undersök effekterna av gener på sjukdom

en anledning forskare genomför Rosa26 knock-in studier är att se hur en gen påverkar utvecklingen av en sjukdom. Flera sjukdomar har misstänkt genetiska länkar, och att lägga till eller subtrahera dessa gener från genomet kan avgöra om en enskild gen eller grupp av dem spelar roller i utvecklingen av tillstånd som diabetes eller Alzheimers. till exempel använde forskare Rosa26 knock-in-möss för att undersöka hur Met-receptortyrosinkinaser (RTK) påverkade uppkomsten av amyotrofisk lateral skleros (ALS). Den studien fann att ökning av Met RTK hos möss inte hade någon effekt på motorneuronutveckling. Det minskade dock förlusten av motorneuroner, fördröjde als-början och förlängde livet för möss med ALS.

studera platsen i olika arter

en annan användbar aspekt av denna plats är dess närvaro i olika arter. Även om Rosa26-lokusen ursprungligen kännetecknades hos möss, är den också närvarande hos människor, grisar, råttor, möss och kaniner. År 2018 identifierade forskare framgångsrikt Rosa26-platsen i nötkreatur. För att bevisa effekten av Rosa26 som en säker hamn hos nötkreatur införde forskare gener i denna plats och producerade en cellinje för användning i framtida studier.

studie av Rosa26 Locus hos människor

medan studier av geninsättningar hos möss kan hjälpa framtida humangenetisk forskning, är användningen av Rosa26 hos människor ännu inte möjlig. Till skillnad från platsen hos möss är Rosa26 hos människor nära kritiska gener. Genredigering av Rosa26-platsen hos människor kan därför störa funktionen hos dessa andra gener. Eftersom effekten av att lägga till gener på denna plats hos människor kan ha okända effekter, kan Rosa26 inte vara en säker hamninsättningsplats hos människor. AAVS1 är dock en säker hamnplats i det mänskliga genomet.

ytterligare fördelar med Rosa26 Knock-in möss

Rosa26 locus erbjuder flera fördelar jämfört med andra platser på genomet, vilket gör det till ett idealiskt alternativ för platsspecifik geninsättning.

färre möss behövs

eftersom forskare känner till den specifika platsen för att infoga gener, kräver de färre möss för framgång. Behovet av färre möss minskar de resurser och tid som krävs, vilket möjliggör ytterligare studier inom andra områden.

högre framgångsgrader

i transgena möss integreras DNA slumpmässigt i genomet och transgenkopian är variabel. När man riktar sig mot Rosa26-platsen uppnår forskare högre framgångsgrader på grund av den kända platsen och större förutsägbarhet för resultat jämfört med äldre transgenteknik.

stabil plats

genetiska Infogningar kan inte göras på någon position i musgenomet, eftersom vissa platser kodar för proteiner med kritiska funktioner. Däremot är Rosa26 locus en säker hamn som inte kommer att störa genfunktionen. Därför tillåter införande av gener med mutationer eller fluorescerande reportrar vid Rosa26-lokusen att den nya genen uttrycks utan störningar.

reproducerbarhet av resultat

många grundare (F0 generation) möss produceras när en transgen modell genereras. Dessa grundare hade dock olika genetiska resultat, och de var nästan omöjliga att reproducera. En del av denna fråga avser transgenkopianummer och loci-skillnader i varje modell. För Rosa26 har forskare ett distinkt locus som gör det möjligt för dem och andra forskare att reproducera experimentella resultat.

uttrycklig Målgen efter celldifferentiering

 uttrycklig Målgen efter celldifferentiering

uttrycklig Målgen efter celldifferentiering

så småningom kommer embryonala celler att differentieras till olika kroppsceller som kommer att bilda vävnader, blod, organ, ben och andra delar av kroppen. Vid användning av Rosa26-platsen och införande av en målgen visas det resulterande uttrycket av genen i cellerna efter denna differentieringshändelse.

detta utbredda uttryck förklarar varför även vuxna möss från denna metod för genredigering fortfarande visar mutationens egenskaper. Genens förmåga att spåra genom olika cellförändringar gör den idealisk för forskare som vill undersöka hur celler förändras genom organismens liv från foster till vuxen.

Hur skapar forskare Rosa26 KI-möss?

att sätta in gener i Rosa26-lokuset kan åstadkommas antingen genom att använda riktade embryonala stamceller eller via CRISPR/Cas9-systemet. En floxad sekvens, som ofta innehåller neomycin, placeras framför en gen av intresse för att förhindra att den transkriberas och därefter uttrycks.

för villkorat uttryck använder forskare Cre-lox-systemet. Genom att korsa en villkorlig” floxad ” mus med en mus som uttrycker Cre-rekombinas raderas DNA-sekvenser som finns i den floxade sekvensen. Utan LoxP-3xstop-LoxP uppströms om genen kan genen nu transkriberas. Tills denna Cre deleter tar bort stoppfunktionen, kommer cellen att bete sig normalt utan att uttrycka genen. Med hjälp av denna villkorliga inkopplingsmetod kan forskare kontrollera när gener uttrycks i olika celler eller vävnader.

typiskt innehåller den infogade kassetten också en reporter för att spåra genens uttryck. I många studier av denna plats har forskare använt lacZ, en bakteriegen, som reporter eftersom den inte är integrerad i exoner eller introner, producerar den inte uttryck. När lacZ får uttrycka sig, främjar Lacz uttrycket av det i varje vuxen vävnad.

förbättrad användning av CRISPR / Cas9-teknik gör det möjligt för forskare att också använda denna metod för att knacka i gener på Rosa26-platsen. Jämfört med äldre sätt att injicera zygoter skapade CRISPR högre framgångsgrader. Äldre metoder gav endast 10% till 20% av levande grundarmutanter, medan CRISPR-producerade möss hade en 50% framgångsgrad med livskraft och mutation.

CRISPR RNA (crRNA) och TRACER RNA (tracrRNA) binder båda tillsammans med varandra och med målgensekvensen. Processen kräver crRNA för att identifiera DNA i sekvensen medan Cas9-proteiner behöver tracrRNA för sin aktivitet.

för att generera en knock-in-mus genom CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 och en inriktningsvektor injiceras i muszygoten. De 2 rna: erna styr Cas9-nukleaset till en specifik plats i genomet (t.ex. Rosa26), och Cas9 gör att dubbelsträngen bryts. Cellen kommer att reparera det trasiga DNA genom en process som kallas homologi-directed repair (HDR). Gener av intresse inom en målvektor blir införlivade eller införda i Rosa26 locus. Biocytogens EGE-system påskyndar HDR och skär därför ner tiden för att screena F0-möss.

för att verifiera noggrannheten i resultaten ger Southern blot-analysen det främsta sättet att screena för slumpmässiga Infogningar. Eftersom inriktningsvektorn kan producera slumpmässiga Infogningar i 32% av CRISPR-projekten blir Southern blot-analys ett kritiskt verktyg för att testa de färdiga produkterna. Med detta test verifieras positionen och kopieringsnumret i genen för noggrannhet.

Varför använda Rosa26 möss i din forskning?

rosa26 möss för forskning

för forskningsinstitutioner som använder musgenetiska modeller spelar tillförlitligheten av resultaten en avgörande roll för att bestämma var djuren ska källa. Verifiering av resultat, en lång rekord av framgångar och många nöjda kunder är tecken på en kvalitetskälla för Rosa26-Möss och andra genetiska tjänster.

Biocytogen kan generera Rosa26 knock-in och villkorliga knock-in-möss för att hjälpa forskare att ta itu med vetenskapliga frågor. Vi är tjänsteleverantörer och innovatörer. Vår egenutvecklade EGE-metod påskyndar HR för snabbare resultat utan att offra noggrannheten. Ingen kärnanläggning eller leverantör har denna fördel.

Biocytogen erbjuder en 100% nöjdhetsgaranti. För mer information om våra skräddarsydda lösningar eller för förfrågningar om vår Rosa26 mice creation process, kontakta oss.

dela:

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.