het nut van de Rosa26 Knock-In muis

Wat is de rosa 26 knock-in

Wat is de rosa 26 knock-in

de rosa26 locus in het muizengenoom is een “veilige haven” die onderzoekers in staat stelt om genen van belang uit te drukken. De verschillende gen die technologieën richten (embryonale stamcellen; CRISPR) worden gebruikt om specifieke DNA-inserties bij de plaats Rosa26 te maken. De grondgedachte voor wetenschappers om Rosa26 en andere belangrijke voordelen te gebruiken om dit type van muis genetisch model te gebruiken zal worden besproken.

Wat is de Rosa26-Locus?In het begin van de jaren negentig werd Rosa26 geïsoleerd door onderzoekers, waardoor wetenschappers een specifieke plaats kregen voor het inbrengen van genen om te bestuderen. Hiervoor gebruikten genetici transgene muismodellen om hypothesen te testen. Transgene muizen worden gegenereerd door plasmide DNA in een pronucleus te injecteren. Één beperking van transgenese is dat plasmidedna willekeurig in het muizengenoom integreert.

wetenschappelijk aangeduid als GtROSA26, wordt deze locus gevonden op chromosoom 6 van muizen. Het codeert een niet-essentieel RNA dat door het lichaam en elke cel/weefsel in het lichaam herhaalt dat het uitdrukt. Daarom verstrekt deze locus een nuttige plaats voor het maken van geninserties en het bestuderen hoe proteã nen het gehele lichaam beà nvloeden.

wetenschappers creëerden deze lijn aanvankelijk door embryonale stamcel-retrovirale genentranpping. De wetenschappers identificeerden embryonale stamcellen die dit als proviral exemplaar bevatten en injecteerden hen in blastocysten. Onderzoekers scheidden de muizen die de Rosa26 insertion hadden voor toekomstige studie. Geen cellen hadden de vector Gen–ROSAßgeo Native, die wetenschappers nodig om degenen die nodig zijn vanaf nul te creëren.

voorafgaand aan gen targeting, creëerden onderzoekers transgene muizen. Dit werd bereikt door plasmide DNA — transgene — in de muis pronucleus te injecteren. Een nadeel aan deze methode is dat transgen willekeurig integreert in het muizengenoom. In tegenstelling, staat het gen richten wetenschappers toe om of “knockout” een gen van belang toe of een toevoeging — klop-in — bij een specifieke plaats in het muizengenoom te maken. De rosa26 locus is een nuttige plaats voor het invoegen van een gen, de plaats van de insertie is bekend — niet willekeurig — en het staat wetenschappers toe om een gen te bestuderen zonder de functie van andere genen te beïnvloeden.

Knock-in modellen met behulp van deze locus bieden een grotere nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten. Traditioneel, werden deze klop-in muizen geproduceerd gebruikend de embryonale stamcellen van de muis, en dit proces is efficiënter met de komst van CRISPR-technologie geworden. Biocytogen gebruikt zijn eigen CRISPR / Cas9-gebaseerde Extreme genoom het uitgeven (EGE™) systeem om snellere resultaten te verkrijgen door homologe nieuwe combinatie 10 tot 20 vouwen te verhogen.

Waarom Wordt Rosa26 Gebruikt?

vanwege het gemak waarmee DNA kan worden ingebracht, is de Rosa26-locus op Muis-chromosoom 6 zeer nuttig voor wetenschappers. Omdat deze locus codeert voor een niet-essentieel RNA en niet voor een gen dat een kritische functie dient, missen inserties nadelige effecten. De stabiele aard van de plaats en de capaciteit voor wetenschappers om globale of voorwaardelijke genuitdrukking te controleren maken het rosa26 muismodel een veelzijdig genetisch hulpmiddel.

Onderzoekscellijnen

onderzoekscellijnen

studiecellijnen

door een reporter-gen aan deze locus toe te voegen, kunnen onderzoekers cellijnen traceren. De capaciteit om genen door een lijn te volgen staat voor een meer diepgaande studie toe van hoe genetische code overgaat en zich over generaties uitdrukt.

door de reporter te vervangen door een toxine, kunnen wetenschappers cellijnen ableren. Het uitschakelen van genen is een methode die wordt gebruikt om te bestuderen hoe de afwezigheid van bepaalde genen een organisme zal beïnvloeden. Een dergelijke studie wordt vooral nuttig in het identificeren van genfunctie door zijn afwezigheid.

het bestuderen van genexpressie in het hele lichaam

het hoge expressieniveau van genen die in de Rosa26-site zijn ingebracht, maakt het wenselijk voor onderzoekers. Een 1997 studie van muizen gegroeid uit embryonale stamcellen besmet met ROSAßgeo retrovirus toonde expressie door elk weefsel in het lichaam.

Chimera analyse

Chimera analyse is een andere toepassing van de Rosa26 muis. Dergelijke studies onderzoeken muizen van twee zygoten die dieren met verschillende genotypes in hun cellen creëren. Sommige dieren vertonen uitdrukkingen van deze verschillende genotypes in hun vachtpatroon of cellen.

Rosa26 muizen drukken β-galactosidase door hun cellen uit. Als zodanig, kunnen wetenschappers Rosa26 cellen gebruiken als gemarkeerde wilde allelen. Het kruisen van deze cellen met mutant cellen markeert die veranderde cellen. Deze markers van de Rosa26 site kunnen verschillende genotypes binnen een chimera aangeven.

homozygoten in het onderzoek als gevolg van Knock-In

terwijl muizen met gecombineerde genotypen nuttig blijken voor het onderzoek, zijn muizen met enkelvoudige genotypen als gevolg van Knock-in een gen op de Rosa26-site ook nuttig. In experimenten met behulp van deze locus, homozygoten geproduceerd blijven leven, hoewel weinig in aantal. De levensvatbaarheid van deze muizen zorgt voor de langere studie van de resultaten van het toegevoegde gen op de Rosa26 locatie.

onderzoek embryonale celdifferentiatie

met behulp van de Rosa26-locatie creëerden wetenschappers stabiele cellijnen met proteïnekinase A, CA-PKA. Wanneer de cellen PKA overexpresseerden, hadden zij Grotere differentiatie en vasculaire vorming. De onderzoekers stelden dat het invoegen van doelgenen op de Rosa26-plaats hen in staat zou stellen om beter te bestuderen hoe embryonale cellen in specifieke lichaamscellen veranderen.

onderzoek de effecten van genen op ziekte

 onderzoek de effecten van genen op ziekte

onderzoek de effecten van genen op ziekte

Eén reden waarom wetenschappers rosa26-knock-in-studies uitvoeren is om te zien hoe een gen de ontwikkeling van een ziekte beïnvloedt. Verscheidene ziekten hebben genetische verbindingen vermoed, en het toevoegen of aftrekken van deze genen van het genoom kan bepalen of een individueel gen of een groep van hen rollen in de ontwikkeling van voorwaarden zoals diabetes of Alzheimer spelen. bijvoorbeeld, gebruikten de onderzoekers rosa26 knock-in muizen om te onderzoeken hoe de kinases van de Metreceptortyrosine (RTK) het begin van amyotrophic laterale sclerose (ALS) beïnvloedden. Uit die studie bleek dat het verhogen van de Met RTK bij muizen geen effect had op de ontwikkeling van motorische neuronen. Nochtans, vertraagde het het verlies van motorneuronen, vertraagde ALS begin en breidde het leven van muizen met ALS uit.

het bestuderen van de locatie bij verschillende soorten

een ander nuttig aspect van deze locus is de aanwezigheid in verschillende soorten. Hoewel de rosa26 locus oorspronkelijk werd gekenmerkt bij muizen, is het ook aanwezig bij mensen, varkens, ratten, muizen en konijnen. In 2018 hebben onderzoekers met succes de Rosa26-site bij runderen geïdentificeerd. Om de werkzaamheid van Rosa26 als veilige haven bij runderen te bewijzen, brachten onderzoekers genen in deze plaats in en produceerden een cellijn voor gebruik in toekomstige studies.

onderzoek naar Rosa26 Locus bij de mens

terwijl het bestuderen van geninserties bij muizen zou kunnen helpen bij toekomstig onderzoek naar de menselijke genetica, is het gebruik van Rosa26 bij de mens nog niet mogelijk. In tegenstelling tot de locatie bij muizen, Rosa26 bij mensen is dicht bij kritische genen. Gen het uitgeven van de rosa26 locus in mensen kan, daarom, de functie van deze andere genen verstoren. Omdat de impact van het toevoegen van genen op deze site bij mensen onbekende effecten zou kunnen hebben, Rosa26 kan niet een veilige haven insertie plaats in de mens. Echter, AAVS1 is een veilige haven locus in het menselijk genoom.

bijkomende voordelen van Rosa26 Knock-In muizen

de rosa26 locus biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere locaties op het genoom, waardoor het een ideale optie is voor site-specific gen insertie.

minder muizen hadden

nodig omdat wetenschappers de specifieke plaats voor het inbrengen van genen kennen, hebben ze minder muizen nodig voor succes. De behoefte aan minder muizen vermindert de benodigde middelen en tijd, waardoor verdere studies op andere gebieden mogelijk zijn.

hoger succes

bij transgene muizen wordt DNA willekeurig in het genoom geïntegreerd en is het aantal transgene kopieën variabel. Bij het richten van de rosa26 locus, wetenschappers bereiken hogere tarieven van succes toe te schrijven aan de bekende locatie en grotere voorspelbaarheid van resultaten in vergelijking met oudere transgen technologie.

stabiele locatie

genetische inserties kunnen op geen enkele plaats in het muizengenoom worden gemaakt, omdat sommige locaties eiwitten met kritieke functies coderen. In tegenstelling, de rosa26 locus is een veilige haven die de genfunctie niet zal verstoren. Daarom staat het invoegen van genen met veranderingen of fluorescente verslaggevers bij de plaats Rosa26 voor het nieuwe gen toe om zonder interferentie worden uitgedrukt.

reproduceerbaarheid van de resultaten

talrijke muizen van de F0-generatie worden geproduceerd wanneer een transgeen model wordt gegenereerd. Deze stichters hadden echter verschillende genetische resultaten, en ze waren bijna onmogelijk te reproduceren. Een deel van dit nummer heeft betrekking op het transgene kopieernummer en loci verschillen in elk model. Voor Rosa26 hebben wetenschappers een aparte locus die hen en andere onderzoekers in staat stelt om experimentele resultaten te reproduceren.

Express Target gen na celdifferentiatie

Express Target gen na celdifferentiatie

Express Target gen na celdifferentiatie

uiteindelijk zullen embryonale cellen differentiëren in verschillende lichaamscellen die de weefsels, bloed, organen, botten en andere delen van het lichaam zullen vormen. Bij het gebruik van de plaats Rosa26 en het invoegen van een doelgen, verschijnt de resulterende uitdrukking van het gen in de cellen na deze differentiatiegebeurtenis.

deze wijdverspreide expressie verklaart waarom zelfs volwassen muizen met deze methode van genbewerking nog steeds de eigenschappen van de mutatie vertonen. De capaciteit van het gen om door diverse celveranderingen te volgen maakt het ideaal voor wetenschappers die kijken om te onderzoeken hoe cellen door het leven van het organisme van foetus aan VOLWASSENE veranderen.

hoe maken wetenschappers Rosa26 KI-Muizen?

het inbrengen van genen in de rosa26-locus kan worden bereikt door gebruik te maken van gerichte embryonale stamcellen of via het CRISPR/Cas9-systeem. Een floxed opeenvolging, die vaak neomycine bevat, wordt geplaatst voor een gen van belang om te verhinderen het te transcriberen en vervolgens uit te drukken.

voor voorwaardelijke expressie gebruiken wetenschappers het Cre-lox-systeem. Het kruisen van een voorwaardelijke “floxed” muis met een muis die cre recombinase uitdrukt verwijdert DNA-sequenties gevonden binnen de floxed opeenvolging. Zonder de loxp-3XSTOP-LoxP stroomopwaarts van het gen, kan het gen nu worden getranscribeerd. Totdat deze Cre deleter de stopfunctie verwijdert, zal de cel zich normaal gedragen zonder het gen uit te drukken. Gebruikend deze voorwaardelijke klop-in methode, kunnen de wetenschappers controleren wanneer de genen in verschillende cellen of weefsels worden uitgedrukt.

normaal gesproken bevat de ingevoegde cassette ook een reporter om de expressie van het gen te volgen. In vele studies van deze plaats, hebben de wetenschappers lacZ, een bacterieel gen, als verslaggever gebruikt omdat tenzij geïntegreerd in exons of introns, het geen uitdrukking produceert. Wanneer lacZ zichzelf mag uitdrukken, bevordert het de expressie van β-galactosidase in elk volwassen weefsel.

door het verbeterde gebruik van CRISPR/Cas9-technologie kunnen wetenschappers deze methode ook gebruiken om genen op de Rosa26-locatie in te kloppen. Vergeleken met oudere middelen om zygotes te injecteren, creëerde CRISPR hogere succespercentages. Oudere methodes leverden slechts 10% tot 20% van levende stichtermutanten op, terwijl CRISPR-geproduceerde muizen een slagingspercentage van 50% met levensvatbaarheid en verandering hadden.

CRISPR-RNA (crRNA) en TRACER-RNA (tracrRNA) binden beide met elkaar en met de sequentie van het doelgen. Het proces vereist crRNA om DNA in de opeenvolging te identificeren terwijl de proteã nen van Cas9 tracrRNA voor hun activiteit nodig hebben.

om een knock-in muis te genereren via CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 en een doelvector worden geïnjecteerd in de muis zygote. 2 RNAs leiden de nuclease Cas9 aan een specifieke plaats in het genoom (b.v. Rosa26), en Cas9 maakt de dubbel-bundelbreuk. De cel zal het gebroken DNA herstellen door middel van een proces genaamd homology-directed repair (HDR). De genen van belang binnen een het richten vector worden opgenomen of in rosa26 locus ingevoegd. Biocytogen ‘ s EGE-systeem versnelt HDR, waardoor minder tijd nodig is om F0-muizen te screenen.

om de nauwkeurigheid van de resultaten te verifiëren, is de Southern blot analysis het belangrijkste middel voor het screenen op willekeurige inserties. Omdat de gerichte vector willekeurige inserties in 32% van CRISPR-projecten kan veroorzaken, wordt de Zuidelijke vlekanalyse een kritisch hulpmiddel bij het testen van de afgewerkte producten. Met deze test worden de positie en het kopieernummer in het gen geverifieerd op nauwkeurigheid.

waarom Rosa26-muizen gebruiken in uw onderzoek?

rosa26 muizen voor onderzoek

voor onderzoeksinstellingen die genetische modellen van muizen gebruiken, speelt de betrouwbaarheid van de resultaten een cruciale rol bij het bepalen waar de dieren worden geboren. Verificatie van de resultaten, een lange staat van dienst van successen en talrijke tevreden klanten zijn tekenen van een kwaliteitsbron voor Rosa26 muizen en andere genetische diensten.

Biocytogeen kan Rosa26 knock-in en voorwaardelijke knock-in muizen genereren om onderzoekers te helpen wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Wij zijn dienstverleners en vernieuwers. Onze eigen Ege-methode versnelt HR voor snellere resultaten zonder in te boeten aan nauwkeurigheid. Geen enkele kernfaciliteit of leverancier heeft dit voordeel.

Biocytogeen biedt een 100% tevredenheidsgarantie. Neem contact met ons op voor meer informatie over onze maatwerk oplossingen of voor vragen over ons Rosa26 mice creation proces.

aandeel:

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.