Nytten Av Rosa26 Knock-In Mus

hva er rosa 26 knock-In

hva er rosa 26 knock-in

Rosa26 locus i musgenomet er en «trygg havn» som tillater forskere å uttrykke gener av interesse. Ulike genmålrettingsteknologier (embryonale stamceller; CRISPR) brukes til å lage spesifikke DNA-innsettinger på Rosa26 locus. Begrunnelsen for forskere å bruke Rosa26 og andre viktige fordeler ved å bruke denne typen musgenetisk modell vil bli diskutert.

Hva Er Rosa26 Locus?

i begynnelsen Av 1990-tallet isolerte forskere Rosa26, noe som ga forskere et bestemt sted for å sette inn gener for å studere. Før dette brukte genetikere transgene musemodeller for å teste hypoteser. Transgene mus genereres ved å injisere plasmid DNA i en pronucleus. En begrensning av transgenese er at plasmid DNA tilfeldig integreres i musgenomet.

Vitenskapelig referert Til Som GtROSA26, er dette locus funnet på kromosom 6 av mus. Det koder for et ikke-essensielt RNA som replikerer gjennom hele kroppen og hver celle/vev i kroppen som uttrykker det. Derfor gir dette locus et nyttig sted for å lage geninnsatser og studere hvordan proteiner påvirker hele kroppen.

Forskere opprettet opprinnelig denne linjen gjennom embryonal stamcelle retroviral genfangst. Forskere identifiserte embryonale stamceller som inneholdt dette som en proviral kopi og injiserte dem i blastocyster. Forskere separerte musene som Hadde Rosa26-innsetting for fremtidig studie. Ingen celler hadde vektoren Gen-Rosaß opprinnelig, noe som krevde forskere å lage de som trengs fra bunnen av.

før genmålretting skapte forskere transgene mus. Dette ble oppnådd ved å injisere plasmid DNA — transgen — inn i musens pronucleus. En ulempe med denne metoden er at transgenet tilfeldig integreres i musgenomet. I kontrast tillater genmålretting forskere å enten «knockout» et gen av interesse eller gjøre en innsetting — knock-in — på et bestemt sted i musgenomet. Den Rosa26 locus er et nyttig sted for å sette inn et gen, plasseringen av innsetting er kjent-ikke tilfeldig – og det tillater forskere å studere et gen uten å påvirke funksjonen av andre gener.

Knock-in modeller som bruker dette locus gir større nøyaktighet og reproduserbarhet av resultater. Tradisjonelt ble disse knock-in musene generert ved hjelp av musembryonale stamceller, og denne prosessen har blitt mer effektiv med adventen AV CRISPR-teknologi. Biocytogen bruker sitt proprietære CRISPR / Cas9-baserte Ekstreme Genomredigeringssystem (EGE™) for å oppnå raskere resultater ved å øke den homologe rekombinasjonen 10 til 20 ganger.

Hvorfor Brukes Rosa26?

På GRUNN Av sin enkle banke I DNA, Er Rosa26 locus på mus kromosom 6 svært nyttig for forskere. Fordi dette locus koder for en uvesentlig RNA og ikke et gen som tjener en kritisk funksjon, innsettinger mangler bivirkninger. Den stabile naturen til nettstedet og evnen til forskere til å kontrollere globalt eller betinget genuttrykk gjør Rosa26-musemodellen til et allsidig genetisk verktøy.

Studiecellelinjer

 studiecellelinjer

studere cellelinjer

ved å legge til en reporter genet til dette locus, kan forskere spore cellelinjer. Evnen til å følge gener gjennom en linje gir en mer grundig studie av hvordan genetisk kode går ned og uttrykker seg over generasjoner.

Erstatte reporteren med en gift, forskere kan ablate cellelinjer. Å slå ut gener er en metode som brukes til å studere hvordan fraværet av visse gener vil påvirke en organisme. En slik studie blir spesielt nyttig for å identifisere genfunksjon gjennom fravær.

Studier Av Genuttrykk I Hele Kroppen

det høye ekspresjonsnivået av gener satt inn I Rosa26-siden gjør det ønskelig for forskere. En 1997 studie av mus dyrket fra embryonale stamceller infisert Med Rosaß retrovirus viste uttrykk gjennom hvert vev i kroppen.

Chimera Analyse

Chimera analyse er en annen anvendelse Av Rosa26 musen. Slike studier undersøker mus fra to zygoter som lager dyr med forskjellige genotyper i sine celler. Noen dyr viser uttrykk for de ulike genotyper i deres pels mønster eller celler.

Rosa26-mus uttrykker β-galaktosidase gjennom sine celler. Som sådan kan forskere bruke Rosa26-celler som merkede vill alleler. Kryssing av disse cellene med mutantceller markerer de endrede cellene. Disse markørene Fra Rosa26-siden kan indikere forskjellige genotyper i en kimær.

Studie Homozygoter Som Følge Av Knock-In

mens mus med kombinerte genotyper vise seg nyttig for studien, mus med entall genotyper fra banket i et gen På Rosa26 stedet er også gunstig. I eksperimenter som bruker dette locus, homozygoter produsert forbli i live, men få i antall. Levedyktigheten til disse musene sikrer en lengre studie av resultatene av det tilsatte genet På Rosa26-stedet.

Undersøk Embryonal Celledifferensiering

ved Hjelp Av Rosa26-siden skapte forskere stabile cellelinjer som inkluderte proteinkinase A, CA-PKA. Når celler overuttrykt PKA, hadde de større differensiering og vaskulær dannelse. Forskerne hevdet at innsetting av målgener på Rosa26-siden ville tillate dem å bedre studere hvordan embryonale celler endres til bestemte kroppsceller.

Undersøke Effekten Av Gener på Sykdom

 undersøke effekten av gener på sykdom

undersøke effekten av gener på sykdom

en grunn forskere gjennomføre Rosa26 knock-in studier er å se hvordan et gen påvirker utviklingen av en sykdom. Flere sykdommer har mistanke om genetiske koblinger, og å legge til eller trekke disse genene fra genomet kan avgjøre om et individuelt gen eller en gruppe av dem spiller roller i utviklingen av tilstander som diabetes eller Alzheimers. for eksempel brukte forskere Rosa26 knock-in-mus for å undersøke hvordan Met-reseptortyrosinkinaser (RTK) påvirket utbruddet av amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Den studien fant at økende Met RTK hos mus ikke hadde effekt på motorneuronutvikling. Det reduserte imidlertid tapet av motorneuroner, forsinket als-utbruddet og utvidet livet til mus med ALS.

Studerer Lokaliseringen I Ulike Arter

Et annet nyttig aspekt ved dette lokus er dens tilstedeværelse i ulike arter. Selv Om Rosa26 locus opprinnelig ble karakterisert hos mus, er Det også tilstede hos mennesker, griser, rotter, mus og kaniner. I 2018 identifiserte forskere Vellykket Rosa26-området i storfe. For å bevise effekten Av Rosa26 som en trygg havn i boviner, satte forskere gener inn i dette stedet og produserte en cellelinje for bruk i fremtidige studier.

Studie Av Rosa26 Locus Hos Mennesker

mens studere genet innsettinger i mus kan hjelpe fremtidig human genetikk forskning, bruk Av Rosa26 hos mennesker er ennå ikke mulig. I motsetning til plasseringen i mus, Er Rosa26 hos mennesker nær kritiske gener. Genredigering Av Rosa26-locus hos mennesker kan derfor forstyrre funksjonen til disse andre gener. Fordi virkningen av å legge til gener på dette stedet hos mennesker kan ha ukjente virkninger, Kan Rosa26 ikke være et trygt havneinnføringssted hos mennesker. AAVS1 er imidlertid et trygt havnepunkt i det menneskelige genom.

Ytterligere Fordeler Med Rosa26 Knock-In Mus

Rosa26 locus tilbyr flere fordeler over andre steder på genomet, noe som gjør Det til et ideelt alternativ for stedsspesifikk geninnsetting.

Færre Mus Trengs

fordi forskere kjenner det spesifikke stedet for å sette inn gener, krever de færre mus for å lykkes. Behovet for færre mus reduserer ressurser og tid som kreves, slik at videre studier på andre områder.

Høyere Suksessrate

I transgene mus er DNA tilfeldig integrert i genomet og transgen kopi nummeret er variabelt. Når man målretter Mot Rosa26 locus, oppnår forskere høyere suksessrate på grunn av den kjente plasseringen og større forutsigbarhet av resultater sammenlignet med eldre transgen teknologi.

Stabil Plassering

Genetiske innsettinger kan ikke gjøres i noen posisjon i musgenomet, da noen steder koder proteiner med kritiske funksjoner. I motsetning Er Rosa26 locus en trygg havn som ikke vil forstyrre genfunksjonen. Derfor setter inn gener med mutasjoner eller fluorescerende journalister På Rosa26 locus det nye genet som skal uttrykkes uten forstyrrelser.

Reproduserbarhet Av Resultater

Tallrike grunnlegger (f0 generasjon) mus produseres når en transgen modell genereres. Disse grunnleggerne hadde imidlertid forskjellige genetiske resultater, og de var nesten umulige å reprodusere. En del av dette problemet gjelder transgen kopi nummer og loci forskjeller i hver modell. For Rosa26 har forskere et tydelig locus som tillater dem og andre forskere å reprodusere eksperimentelle resultater.

Ekspressmålgen Etter Celledifferensiering

 Ekspressmålgen Etter Celledifferensiering

Express Målgen Etter Celledifferensiering

til Slutt vil embryonale celler skille seg i forskjellige kroppsceller som vil danne vev, blod, organer, bein og andre deler av kroppen. Når Du bruker Rosa26-siden og setter inn et målgen, vises det resulterende uttrykket av genet i cellene etter denne differensieringshendelsen.

dette utbredte uttrykket forklarer hvorfor selv voksne mus fra denne metoden for genredigering fortsatt viser egenskapene til mutasjonen. Genets evne til å spore gjennom ulike celleforandringer gjør det ideelt for forskere som ønsker å undersøke hvordan celler endrer seg gjennom organismenes liv fra foster til voksen.

Hvordan Forskere Lage Rosa26 Ki Mus?

Innsetting av gener i Rosa26 locus kan oppnås enten ved å bruke målrettede embryonale stamceller eller VIA CRISPR/Cas9-systemet. En floxed sekvens, som ofte inneholder neomycin, er plassert foran et gen av interesse for å hindre det i å transkribere og deretter uttrykke.

for betinget uttrykk bruker forskere Cre-lox-systemet. Kryssing av en betinget» floxed » mus med en mus som uttrykker Cre rekombinase, sletter DNA-sekvenser funnet i floxed-sekvensen. Uten LoxP-3xstop-LoxP oppstrøms av genet, kan genet nå transkriberes. Inntil Denne Cre-deleteren fjerner stoppfunksjonen, vil cellen oppføre seg normalt uten å uttrykke genet. Ved hjelp av denne betingede knock-in-metoden kan forskere kontrollere når gener uttrykkes i forskjellige celler eller vev.

vanligvis inneholder den innsatte kassetten også en reporter for å spore genets uttrykk. I mange studier av dette locus har forskere brukt lacZ, et bakterielt gen, som reporter fordi det ikke produserer uttrykk med mindre det er integrert i eksoner eller introner. Når lacZ får lov til å uttrykke seg, fremmer lacz β‐galaktosidaseuttrykk i hvert voksent vev.

Forbedret BRUK AV CRISPR / Cas9-teknologi tillater forskere å også bruke denne metoden for å banke i gener På Rosa26-siden. Sammenlignet med eldre metoder for å injisere zygoter, SKAPTE CRISPR høyere suksessrate. Eldre metoder ga bare 10% til 20% av levende grunnlegger mutanter, mens CRISPR-produserte mus hadde en 50% suksessrate med levedyktighet og mutasjon.

CRISPR RNA (crRNA) og TRACER RNA (tracrRNA) binder begge sammen med hverandre og med målgensekvensen. Prosessen krever crRNA å identifisere DNA i sekvensen Mens Cas9 proteiner trenger tracrRNA for deres aktivitet.

for å generere en knock-in mus GJENNOM CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9, og en målretting vektor injiseres i musen zygote. De 2 Rna lede Cas9 nuklease til et bestemt sted I genomet (F. Eks Rosa26), Og Cas9 gjør dobbel-tråd pause. Cellen vil reparere det ødelagte DNA gjennom en prosess som kalles homology-directed repair (HDR). Gener av interesse i en målrettingsvektor blir innlemmet eller satt inn I Rosa26-locus. Biocytogens EGE-system øker HDR, og reduserer derfor tiden For å skjerme F0-mus.

For å verifisere nøyaktigheten av resultatene, Gir Southern blot analyse det viktigste middel for screening for tilfeldige innsettinger. Fordi målrettingsvektoren kan produsere tilfeldige innsettinger i 32% AV CRISPR-prosjektene, Blir Southern blot-analyse et kritisk verktøy for å teste de ferdige produktene. Med denne testen blir posisjon og kopi nummer i genet verifisert for nøyaktighet.

Hvorfor Bruke Rosa26 Mus i Din Forskning?

rosa26-mus for forskning

for forskningsinstitusjoner som bruker musgenetiske modeller, spiller påliteligheten av resultatene en avgjørende rolle i å bestemme hvor dyrene skal kilde. Verifisering av resultater, en lang rekord av suksesser og mange fornøyde kunder er tegn på en kvalitetskilde For Rosa26-mus og andre genetiske tjenester.

Biocytogen kan generere Rosa26 knock-in og betinget knock-in mus for å hjelpe forskere adresse vitenskapelige spørsmål. Vi er leverandører og innovatører. Vår proprietære EGE-metode gir RASKERE HR for raskere resultater uten å ofre nøyaktighet. Ingen kjernefasilitet eller leverandør har denne fordelen.

Biocytogen tilbyr en 100% tilfredshetsgaranti. For mer informasjon om våre tilpassede løsninger eller for henvendelser Til Vår Rosa26 mice creation process, kontakt oss.

Dele:

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.