Rosa26ノックインマウスの有用性

rosa26ノックインマウスとは何ですか

rosa26ノックインとは何ですか

マウスゲノムのRosa26遺伝子座は、研究者が関心のある遺伝子を発現させることを可能にする「安全な港」です。 異なる遺伝子標的化技術(胚性幹細胞;CRISPR)を使用して、Rosa2 6遺伝子座に特異的DNA挿入を行う。 科学者がRosa26を使用するための理論的根拠と、このタイプのマウス遺伝モデルを使用するための他の主要な利点について議論する。

Rosa26遺伝子座とは何ですか?

1990年代初頭、研究者はRosa26を単離し、科学者に研究のための遺伝子を挿入するための特定の部位を与えた。 これに先立ち、遺伝学者は、仮説をテストするためにトランスジェニックマウスモデルを使用しました。 トランスジェニックマウスは、前核にプラスミドDNAを注入することによって生成される。 遺伝子導入の1つの制限は、プラスミドDNAがマウスゲノムにランダムに組み込まれることである。

科学的にGtrosa26と呼ばれ、この遺伝子座はマウスの6番染色体に見られます。 それは、体全体およびそれを発現する体内のすべての細胞/組織を複製する必須でないRNAをコードします。 したがって、この遺伝子座は、遺伝子挿入を行い、タンパク質が全身にどのように影響するかを研究するための有用な場所を提供する。

科学者たちは当初、胚性幹細胞レトロウイルス遺伝子トラップを通じてこの系統を作成しました。 科学者たちは、これをプロウイルスのコピーとして含む胚性幹細胞を同定し、それらを胚盤胞に注入した。 研究者は、将来の研究のためにRosa26挿入を持っていたマウスを分離しました。 ベクター Gen–Rosačgeoをネイティブに持っていた細胞はなく、科学者は必要なものを最初から作成する必要がありました。

遺伝子標的化の前に、研究者はトランスジェニックマウスを作成しました。 これは、プラスミドDNA—導入遺伝子—をマウス前核に注入することによって達成された。 この方法の一つの欠点は、導入遺伝子がマウスゲノムにランダムに統合されることである。 対照的に、遺伝子標的化は、科学者が関心のある遺伝子を「ノックアウト」するか、またはマウスゲノム内の特定の部位に挿入ノックインを行うことを可 Rosa26遺伝子座は遺伝子を挿入するのに有用な場所であり、挿入の位置はランダムではなく知られており、科学者は他の遺伝子の機能に影響を与えずに遺伝子を研究することができる。

この軌跡を使用したノックインモデルは、結果のより高い精度と再現性を提供します。 伝統的に、これらのノックインマウスは、マウス胚性幹細胞を用いて生成され、このプロセスは、CRISPR技術の出現により、より効率的になっています。 Biocytogenは、独自のCRISPR/Cas9ベースのExtreme Genome Editing(EGE™)システムを使用して、相同組換えを10〜20倍に増加させることにより、より迅速な結果を得ることができます。

なぜRosa26が使われているのですか?

DNAのノックの容易さのために、マウス染色体6上のRosa26遺伝子座は科学者にとって非常に有用です。 この遺伝子座は、重要な機能を果たす遺伝子ではなく、必須でないRNAをコードするので、挿入は有害な影響を欠いている。 サイトの安定した性質と、科学者がグローバルまたは条件付き遺伝子発現を制御する能力は、Rosa26マウスモデルを汎用性の高い遺伝的ツールにします。

細胞系統の研究

細胞系統の研究

細胞系統の研究

この遺伝子座にレポーター遺伝子を追加することで、研究者は細胞系統を追跡することができます。 ライン全体で遺伝子を追跡する能力は、遺伝コードがどのように受け継がれ、世代にわたって自分自身を表現するかをより詳細に研究することを可能

レポーターを毒素に置き換えると、科学者は細胞系統を切除することができます。 遺伝子をノックアウトすることは、特定の遺伝子が存在しないことが生物にどのように影響するかを研究するために使用される1つの方法です。 このような研究は、その不在を介して遺伝子機能を同定するのに特に有用である。

体全体の遺伝子発現を研究する

Rosa26部位に挿入された遺伝子の発現レベルが高いことは、研究者にとって望ましいことです。 1997年の研究では、Rosačgeoレトロウイルスに感染した胚性幹細胞から成長したマウスは、体内のすべての組織全体に発現を示した。

キメラ解析

キメラ解析はRosa26マウスの別のアプリケーションです。 このような研究では、細胞内に異なる遺伝子型を持つ動物を作る2つの接合体からマウスを調べます。 いくつかの動物は、それらの毛皮のパターンまたは細胞においてそれらの異なる遺伝子型の発現を示す。

Rosa26マウスは、細胞全体にβ-ガラクトシダーゼを発現する。 そのため、科学者はRosa26細胞を顕著な野生対立遺伝子として使用することができます。 これらの細胞を変異細胞と交差させると、それらの変化した細胞がマークされます。 Rosa26サイトからのこれらのマーカーは、キメラ内の異なる遺伝子型を示すことができます。

ノックインによるホモ接合体の研究

遺伝子型を組み合わせたマウスは研究に有用であるが、Rosa26部位の遺伝子をノックすることによる特異な遺伝子型を持つマウスも有益である。 この遺伝子座を用いた実験では、生産されたホモ接合体は生存しているが、数は少ない。 これらのマウスの生存率はRosa26位置で加えられた遺伝子の結果のより長い調査を保障する。

胚細胞分化を調べる

Rosa26サイトを使用して、科学者たちはプロテインキナーゼA、CA-PKAを含む安定した細胞株を作成しました。 細胞がPKAを過剰発現すると、それらはより大きな分化および血管形成を有していた。 研究者らは、Rosa26部位に標的遺伝子を挿入することで、胚細胞が特定の体細胞にどのように変化するかをよりよく研究することができると仮定した。

遺伝子が病気に及ぼす影響を調べる

遺伝子が病気に及ぼす影響を調べる

遺伝子が病気に及ぼす影響を調べる

科学者がRosa26ノックイン研究を実施する理由の1つは、遺伝子が病気の発症にどのように影響するかを調 いくつかの疾患は、遺伝的リンクが疑われている、とゲノムからこれらの遺伝子を加算または減算することは、個々の遺伝子またはそれらのグループは、糖尿病やアルツハイマー病などの条件の開発に役割を果たしているかどうかを判断することができます。例えば、研究者は、Met受容体チロシンキナーゼ(RTK)が筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症にどのように影響を与えたかを調べるためにRosa26ノックインマウスを使用しました。 その研究は、マウスのMet RTKを増加させることは、運動ニューロンの発達に影響を及ぼさなかったことを見出した。 しかし、それは運動ニューロンの損失を遅らせ、ALSの発症を遅らせ、ALSを有するマウスの寿命を延長した。

様々な種の位置を研究する

この遺伝子座のもう一つの有用な側面は、異なる種におけるその存在である。 Rosa26遺伝子座はもともとマウスで特徴づけられたが、それはまた、ヒト、ブタ、ラット、マウスおよびウサギに存在する。 2018年、研究者らはウシのRosa26サイトの同定に成功しました。 ウシの安全な港としてのRosa26の有効性を証明するために、研究者はこの遺伝子座に遺伝子を挿入し、将来の研究で使用するための細胞株を産生した。

ヒトにおけるRosa26遺伝子座の研究

マウスの遺伝子挿入を研究することは将来のヒト遺伝学研究に役立つ可能性がありますが、ヒトにおけるRosa26の使用はまだ可能ではありません。 マウスの位置とは異なり、ヒトのRosa26は重要な遺伝子に近い。 したがって、ヒトにおけるRosa26遺伝子座を編集する遺伝子は、これらの他の遺伝子の機能を破壊する可能性がある。 ヒトにおけるこの部位に遺伝子を添加することの影響は未知の影響を有する可能性があるため、Rosa26はヒトにおける安全な港の挿入部位ではな しかし、AAVS1はヒトゲノム中のセーフハーバー遺伝子座である。

Rosa26ノックインマウスの追加の利点

Rosa26遺伝子座は、ゲノム上の他の場所よりもいくつかの利点を提供し、部位特異的遺伝子挿入のための理想的

必要なマウスの数

科学者は遺伝子を挿入するための特定の部位を知っているため、成功のために必要なマウスの数が少なくなります。 少数のマウスのための必要性は必要な資源および時間を減らし他の区域のそれ以上の調査を可能にする。

成功率が高い

トランスジェニックマウスでは、DNAがランダムにゲノムに組み込まれ、導入遺伝子のコピー数は可変です。 Rosa26遺伝子座を標的とする場合、科学者は、古い導入遺伝子技術と比較して、既知の位置と結果のより大きな予測可能性のために、より高い成功率を達成

安定した位置

いくつかの場所は重要な機能を持つタンパク質をコードするため、マウスゲノムのどの位置にも遺伝的挿入を行うことはできません。 対照的に、Rosa26遺伝子座は、遺伝子機能を破壊しない安全な港である。 したがって、突然変異または蛍光レポーターを有する遺伝子をRosa2 6遺伝子座に挿入することは、新しい遺伝子を干渉なしに発現させることを可能にする。

結果の再現性

トランスジェニックモデルが生成されると、多数のfounder(F0世代)マウスが生成されます。 しかし、これらの創設者は異なる遺伝的結果を有しており、再現することはほとんど不可能であった。 この問題の一部は、各モデルにおける導入遺伝子のコピー数および遺伝子座の違いに関するものである。 Rosa26のために、科学者は彼らと他の研究者が実験結果を再現することを可能にする明確な軌跡を持っています。

細胞分化後に標的遺伝子を発現

細胞分化後に標的遺伝子を発現

細胞分化後に標的遺伝子を発現する

最終的には、胚細胞は組織、血液、臓器、骨、および身体の他の部分を形成する様々な体細胞に分化します。 Rosa26部位を使用して標的遺伝子を挿入すると、この分化イベントの後に得られた遺伝子の発現が細胞に現れる。

この広範な発現は、この遺伝子編集方法の成体マウスでさえ、依然として突然変異の形質を示す理由を説明している。 様々な細胞の変化を追跡する遺伝子の能力は、胎児から成人までの生物の生命を通して細胞がどのように変化するかを調べる科学者にとって理想的

科学者はRosa26KIマウスをどのように作成しますか?

Rosa26遺伝子座への遺伝子の挿入は、標的化胚性幹細胞を使用するか、またはCRISPR/Cas9システムを介して達成することができる。 多くの場合、ネオマイシンを含むフロックス配列は、転写し、その後発現するからそれを防ぐために、関心のある遺伝子の前に配置されています。

条件式には、科学者はCre-loxシステムを採用しています。 条件付き”floxed”マウスとCreリコンビナーゼを発現するマウスを交配すると、floxed配列内に見られるDNA配列が削除されます。 遺伝子の上流のLoxp−3XSTOP−Loxpがなければ、遺伝子を転写することができる。 このCre deleterが停止機能を除去するまで、細胞は遺伝子を発現せずに正常に動作する。 この条件付きノックイン法を使用して、科学者は遺伝子が異なる細胞または組織でいつ発現されるかを制御することができる。

通常、挿入されたカセットには、遺伝子の発現を追跡するためのレポーターも含まれています。 この遺伝子座の多くの研究では、科学者たちは、エクソンまたはイントロンに統合されない限り、それが発現を産生しないので、レポーターとしてlacZ、細菌遺伝子を使用しています。 それ自体を発現させると、lacZはすべての成人組織においてβ‐ガラクトシダーゼ発現を促進する。

CRISPR/Cas9技術の改良された使用により、科学者はRosa26部位の遺伝子をノックするためにこの方法を使用することもできます。 接合体を注入する古い手段と比較して、CRISPRはより高い成功率を生み出しました。 CRISPR産生マウスは生存率と突然変異で50%の成功率を持っていたのに対し、古い方法は、生きている創始者変異体の10%〜20%しか得られなかった。<5 5 5 2><4 7 9 2>CRISPR RNA(crRNA)とトレーサー RNA(tracrRNA)は共に、標的遺伝子配列と互いに結合する。 このプロセスでは、配列中のDNAを同定するためにcrRNAを必要とし、Cas9タンパク質はその活性のためにtracrnaを必要とする。

crisprを介してノックインマウスを生成するために、crRNA、tracrRNA、Cas9、およびターゲティングベクターをマウス接合体に注入する。 2つのRnaはCas9ヌクレアーゼをゲノムの特定の場所に導き(例えばRosa26)、Cas9は二本鎖の壊れ目を作ります。 細胞は、相同性指向修復(HDR)と呼ばれるプロセスを介して壊れたDNAを修復します。 標的化ベクター内の目的の遺伝子は、Rosa2 6遺伝子座に組み込まれるかまたは挿入されるようになる。 BiocytogenのEGEシステムはHDRを高速化し、F0マウスをスクリーニングする時間を短縮します。

結果の正確さを検証するために、サザンブロット分析はランダム挿入のスクリーニングの主要な手段を提供します。 ターゲティングベクターはCRISPRプロジェクトの32%でランダムな挿入を生成する可能性があるため、サザンブロット分析は完成品をテストする上で重要なツールになります。 このテストによって、遺伝子の位置そしてコピー数は正確さのために確認されて得ます。

なぜあなたの研究でRosa26マウスを使用しますか?

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