L’utilità del mouse Knock-in Rosa26

che cos'è il knock-in rosa 26

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Il locus Rosa26 nel genoma del topo è un “porto sicuro” che consente ai ricercatori di esprimere geni di interesse. Diverse tecnologie di targeting genico (cellule staminali embrionali; CRISPR) sono utilizzate per effettuare inserimenti specifici di DNA nel locus Rosa26. Si discuterà la logica per gli scienziati di utilizzare Rosa26 e altri vantaggi chiave per l’utilizzo di questo tipo di modello genetico murino.

Che cos’è il Locus Rosa26?

Nei primi anni 1990, i ricercatori hanno isolato Rosa26, dando agli scienziati un sito specifico per l’inserimento di geni da studiare. Prima di questo, i genetisti usavano modelli murini transgenici per testare le ipotesi. I topi transgenici sono generati iniettando DNA plasmidico in un pronucleo. Una limitazione della transgenesi è che il DNA plasmidico si integra casualmente nel genoma del topo.

Scientificamente indicato come GtROSA26, questo locus si trova sul cromosoma 6 dei topi. Codifica un RNA non essenziale che si replica in tutto il corpo e in ogni cellula/tessuto del corpo che lo esprime. Pertanto, questo locus fornisce un posto utile per fare inserimenti genici e studiare come le proteine hanno un impatto su tutto il corpo.

Gli scienziati hanno inizialmente creato questa linea attraverso l’intrappolamento dei geni retrovirali delle cellule staminali embrionali. Gli scienziati hanno identificato le cellule staminali embrionali che contenevano questo come una copia provirale e le hanno iniettate nelle blastocisti. I ricercatori hanno separato i topi che hanno avuto l’inserimento di Rosa26 per lo studio futuro. Nessuna cellula aveva il vettore Gen-ROSAßgeo in modo nativo, il che richiedeva agli scienziati di creare quelli necessari da zero.

Prima del targeting genetico, i ricercatori hanno creato topi transgenici. Ciò è stato ottenuto iniettando DNA plasmidico-transgene-nel pronucleo del topo. Uno svantaggio di questo metodo è che il transgene si integra casualmente nel genoma del topo. Al contrario, il targeting genetico consente agli scienziati di” knock — out ” un gene di interesse o di effettuare un inserimento-knock — in-in un sito specifico nel genoma del topo. Il locus Rosa26 è un luogo utile per l’inserimento di un gene, La posizione dell’inserimento è nota — non casuale — e consente agli scienziati di studiare un gene senza influenzare la funzione di altri geni.

I modelli knock-in che utilizzano questo locus offrono una maggiore precisione e riproducibilità dei risultati. Tradizionalmente, questi topi knock-in sono stati generati utilizzando cellule staminali embrionali di topo, e questo processo è diventato più efficiente con l’avvento della tecnologia CRISPR. Biocytogen utilizza il suo sistema proprietario basato su CRISPR / Cas9 Extreme Genome Editing (EGE™) per ottenere risultati più rapidi aumentando la ricombinazione omologa da 10 a 20 volte.

Perché si usa Rosa26?

Grazie alla sua facilità di bussare nel DNA, il locus Rosa26 sul cromosoma 6 del topo è molto utile per gli scienziati. Poiché questo locus codifica un RNA non essenziale e non un gene che svolge una funzione critica, gli inserimenti mancano di effetti avversi. La natura stabile del sito e la capacità degli scienziati di controllare l’espressione genica globale o condizionale rendono il modello murino Rosa26 uno strumento genetico versatile.

Linee cellulari di studio

 linee cellulari di studio

studia le linee cellulari

Aggiungendo un gene reporter a questo locus, i ricercatori possono tracciare le linee cellulari. La capacità di seguire i geni in tutta una linea consente uno studio più approfondito di come il codice genetico passa e si esprime nel corso delle generazioni.

Sostituendo il reporter con una tossina, gli scienziati possono ablare i lignaggi cellulari. Knocking out geni è un metodo utilizzato per studiare come l’assenza di alcuni geni influenzerà un organismo. Tale studio diventa particolarmente utile per identificare la funzione genica attraverso la sua assenza.

Studiare l’espressione genica in tutto il corpo

L’alto livello di espressione dei geni inseriti nel sito Rosa26 lo rende desiderabile per i ricercatori. Uno studio del 1997 su topi cresciuti da cellule staminali embrionali infette da retrovirus ROSAßgeo ha mostrato espressione in tutti i tessuti del corpo.

Analisi Chimera

L’analisi Chimera è un’altra applicazione del mouse Rosa26. Tali studi esaminano i topi da due zigoti che creano animali con genotipi diversi nelle loro cellule. Alcuni animali mostrano espressioni di questi diversi genotipi nel loro modello di pelliccia o cellule.

I topi Rosa26 esprimono β-galattosidasi in tutte le loro cellule. Come tale, gli scienziati possono utilizzare le cellule Rosa26 come alleli selvatici marcati. L’incrocio di queste cellule con cellule mutanti segna quelle cellule alterate. Questi marcatori dal sito Rosa26 possono indicare diversi genotipi all’interno di una chimera.

Studio omozigoti Derivanti da Knock-In

Mentre i topi con genotipi combinati si dimostrano utili per lo studio, i topi con genotipi singolari da bussare in un gene nel sito Rosa26 sono anche utili. Negli esperimenti con questo locus, gli omozigoti prodotti rimangono vivi, anche se pochi in numero. La vitalità di questi topi garantisce lo studio più lungo dei risultati del gene aggiunto nella posizione Rosa26.

Esaminare la differenziazione delle cellule embrionali

Utilizzando il sito Rosa26, gli scienziati hanno creato linee cellulari stabili che includevano la proteina chinasi A, CA-PKA. Quando le cellule hanno sovraespresso PKA, hanno avuto una maggiore differenziazione e formazione vascolare. I ricercatori hanno ipotizzato che l’inserimento di geni bersaglio nel sito di Rosa26 consentirebbe loro di studiare meglio come le cellule embrionali si trasformano in specifiche cellule del corpo.

Esaminare gli effetti dei geni sulla malattia

 esaminare gli effetti dei geni sulla malattia

esaminare gli effetti dei geni sulla malattia

Uno dei motivi per cui gli scienziati conducono studi knock-in Rosa26 è vedere come un gene influenza lo sviluppo di una malattia. Diverse malattie hanno legami genetici sospetti, e aggiungendo o sottraendo questi geni dal genoma in grado di determinare se un singolo gene o un gruppo di loro giocano un ruolo nello sviluppo di condizioni come il diabete o l’Alzheimer. Ad esempio, i ricercatori hanno utilizzato Rosa26 knock-in topi per esaminare come Met recettore tirosin chinasi (RTK) influenzato l’insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Questo studio ha rilevato che l’aumento del Met RTK nei topi non ha avuto un effetto sullo sviluppo del motoneurone. Tuttavia, ha rallentato la perdita di motoneuroni, ritardato l’insorgenza della SLA e prolungato la vita dei topi affetti da SLA.

Studiare la posizione in varie specie

Un altro aspetto utile di questo locus è la sua presenza in diverse specie. Sebbene il locus Rosa26 fosse originariamente caratterizzato nei topi, è presente anche negli esseri umani, nei maiali, nei ratti, nei topi e nei conigli. Nel 2018, i ricercatori hanno identificato con successo il sito Rosa26 nei bovini. Per dimostrare l’efficacia di Rosa26 come porto sicuro nei bovini, i ricercatori hanno inserito geni in questo locus e hanno prodotto una linea cellulare da utilizzare in studi futuri.

Studio del locus Rosa26 nell’uomo

Mentre lo studio degli inserimenti genici nei topi potrebbe aiutare la futura ricerca genetica umana, l’uso di Rosa26 nell’uomo non è ancora possibile. A differenza della posizione nei topi, Rosa26 negli esseri umani è vicino ai geni critici. Gene editing il locus Rosa26 negli esseri umani potrebbe, quindi, interrompere la funzione di questi altri geni. Poiché l’impatto dell’aggiunta di geni in questo sito negli esseri umani potrebbe avere impatti sconosciuti, Rosa26 potrebbe non essere un luogo di inserimento sicuro negli esseri umani. Tuttavia, AAVS1 è un porto sicuro locus nel genoma umano.

Ulteriori vantaggi dei topi knock-in Rosa26

Il locus Rosa26 offre diversi vantaggi rispetto ad altre posizioni sul genoma, rendendolo un’opzione ideale per l’inserimento di geni site-specific.

Meno topi necessari

Poiché gli scienziati conoscono il sito specifico per l’inserimento di geni, richiedono meno topi per il successo. La necessità di un minor numero di topi riduce le risorse e il tempo necessario, consentendo ulteriori studi in altre aree.

Più alti tassi di successo

Nei topi transgenici, il DNA è casualmente integrato nel genoma e il numero di copie transgene è variabile. Quando si prende di mira il locus Rosa26, gli scienziati raggiungono tassi di successo più elevati grazie alla posizione nota e alla maggiore prevedibilità dei risultati rispetto alla tecnologia transgene più vecchia.

Posizione stabile

Gli inserimenti genetici non possono essere fatti in nessuna posizione nel genoma del topo, poiché alcune posizioni codificano le proteine con funzioni critiche. Al contrario, il locus Rosa26 è un porto sicuro che non interromperà la funzione genica. Pertanto, l’inserimento di geni con mutazioni o reporter fluorescenti nel locus Rosa26 consente di esprimere il nuovo gene senza interferenze.

Riproducibilità dei risultati

Numerosi topi fondatori (generazione F0) vengono prodotti quando viene generato un modello transgenico. Questi fondatori, però, avevano risultati genetici diversi ed erano quasi impossibili da riprodurre. Parte di questo numero riguarda il numero di copia transgene e le differenze loci in ogni modello. Per Rosa26, gli scienziati hanno un locus distinto che permette loro e altri ricercatori di riprodurre i risultati sperimentali.

Gene bersaglio espresso dopo differenziazione cellulare

Gene bersaglio espresso dopo differenziazione cellulare

Esprimere il gene bersaglio dopo la differenziazione cellulare

Alla fine, le cellule embrionali si differenzieranno in varie cellule del corpo che formeranno i tessuti, il sangue, gli organi, le ossa e altre parti del corpo. Quando si utilizza il sito Rosa26 e si inserisce un gene bersaglio, l’espressione risultante del gene appare nelle cellule dopo questo evento di differenziazione.

Questa espressione diffusa spiega perché anche i topi adulti di questo metodo di editing genetico mostrano ancora i tratti della mutazione. La capacità del gene di monitorare attraverso vari cambiamenti cellulari lo rendono ideale per gli scienziati che cercano di esaminare come le cellule si alterano attraverso la vita dell’organismo dal feto all’adulto.

Come fanno gli scienziati a creare topi Rosa26 KI?

L’inserimento di geni nel locus Rosa26 può essere realizzato utilizzando cellule staminali embrionali mirate o tramite il sistema CRISPR/Cas9. Una sequenza flossata, che spesso contiene neomicina, è posizionata di fronte a un gene di interesse per impedirgli di trascrivere e successivamente esprimere.

Per l’espressione condizionale, gli scienziati utilizzano il sistema Cre-lox. Incrociando un mouse “floxed” condizionale con un mouse che esprime la ricombinasi Cre elimina le sequenze di DNA trovate all’interno della sequenza floxed. Senza il LoxP-3XSTOP-LoxP a monte del gene, il gene può ora essere trascritto. Fino a quando questo deleter Cre rimuove la funzione di arresto, la cellula si comporterà normalmente senza esprimere il gene. Usando questo metodo di knock-in condizionale, gli scienziati possono controllare quando i geni sono espressi in diverse cellule o tessuti.

In genere, la cassetta inserita include anche un reporter per monitorare l’espressione del gene. In molti studi su questo locus, gli scienziati hanno usato lacZ, un gene batterico, come reporter perché se non integrato in esoni o introni, non produce espressione. Quando è permesso di esprimersi, lacZ promuove l’espressione della β‐galattosidasi in ogni tessuto adulto.

L’uso migliorato della tecnologia CRISPR/Cas9 consente agli scienziati di utilizzare questo metodo anche per colpire i geni nel sito Rosa26. Rispetto ai mezzi più vecchi di iniettare zigoti, CRISPR ha creato tassi più elevati di successo. I metodi più vecchi hanno prodotto solo dal 10% al 20% dei mutanti fondatori vivi, mentre i topi prodotti da CRISPR hanno avuto un tasso di successo del 50% con vitalità e mutazione.

L’RNA CRISPR (crRNA) e l’RNA TRACCIANTE (tracrRNA) si legano entrambi tra loro e con la sequenza genica bersaglio. Il processo richiede crRNA per identificare il DNA nella sequenza mentre le proteine Cas9 hanno bisogno di tracrRNA per la loro attività.

Per generare un mouse knock-in attraverso CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 e un vettore di targeting vengono iniettati nello zigote del mouse. I 2 RNA guidano la nucleasi di Cas9 ad un sito specifico nel genoma (per esempio Rosa26) e Cas9 fa la rottura del doppio filamento. La cellula riparerà il DNA rotto attraverso un processo chiamato homology-directed repair (HDR). I geni di interesse all’interno di un vettore di targeting vengono incorporati o inseriti nel locus Rosa26. Il sistema EGE di Biocytogen accelera l’HDR, riducendo quindi il tempo di schermare i topi F0.

Per verificare l’accuratezza dei risultati, Southern blot analysis fornisce il mezzo principale di screening per inserimenti casuali. Poiché il vettore di targeting può produrre inserimenti casuali nel 32% dei progetti CRISPR, Southern blot analysis diventa uno strumento fondamentale per testare i prodotti finiti. Con questo test, la posizione e il numero di copia nel gene vengono verificati per la precisione.

Perché usare i topi Rosa26 nella tua ricerca?

rosa26 topi per la ricerca

Per gli istituti di ricerca che utilizzano modelli genetici murini, l’affidabilità dei risultati gioca un ruolo cruciale nel decidere dove reperire gli animali. La verifica dei risultati, un lungo record di successi e numerosi clienti soddisfatti sono segni di una fonte di qualità per i topi Rosa26 e altri servizi genetici.

Biocytogen può generare topi knock-in e knock-in condizionali Rosa26 per aiutare i ricercatori ad affrontare questioni scientifiche. Siamo fornitori di servizi e innovatori. Il nostro metodo EGE proprietario accelera HR per risultati più rapidi senza sacrificare la precisione. Nessun impianto di base o fornitore ha questo vantaggio.

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