L’utilité de la Souris Knock-in Rosa26

 Qu'est-ce que le rosa 26 knock-in

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Le locus Rosa26 dans le génome de la souris est un « refuge » qui permet aux chercheurs d’exprimer des gènes d’intérêt. Différentes technologies de ciblage génique (cellules souches embryonnaires; CRISPR) sont utilisées pour effectuer des insertions d’ADN spécifiques au locus Rosa26. La raison pour laquelle les scientifiques utilisent Rosa26 et d’autres avantages clés de l’utilisation de ce type de modèle génétique de souris seront discutés.

Qu’est-ce que le Locus Rosa26 ?

Au début des années 1990, les chercheurs ont isolé Rosa26, donnant aux scientifiques un site spécifique pour insérer des gènes à étudier. Avant cela, les généticiens utilisaient des modèles de souris transgéniques pour tester des hypothèses. Les souris transgéniques sont générées par injection d’ADN plasmidique dans un pronucleus. Une limitation de la transgénèse est que l’ADN plasmidique s’intègre de manière aléatoire dans le génome de la souris.

Scientifiquement appelé GTOSA26, ce locus se trouve sur le chromosome 6 de souris. Il code un ARN non essentiel qui se réplique dans tout le corps et dans chaque cellule / tissu du corps qui l’exprime. Par conséquent, ce locus fournit un endroit utile pour faire des insertions de gènes et étudier l’impact des protéines sur l’ensemble du corps.

Les scientifiques ont initialement créé cette lignée par piégeage de gènes rétroviraux de cellules souches embryonnaires. Les scientifiques ont identifié des cellules souches embryonnaires qui en contenaient une copie provirale et les ont injectées dans des blastocystes. Les chercheurs ont séparé les souris qui avaient l’insertion Rosa26 pour une étude future. Aucune cellule n’avait le vecteur Gen–ROSAßgeo nativement, ce qui obligeait les scientifiques à créer ceux dont ils avaient besoin à partir de zéro.

Avant le ciblage génétique, les chercheurs ont créé des souris transgéniques. Cela a été accompli en injectant de l’ADN plasmidique — transgène — dans le pronucleus de la souris. Un inconvénient de cette méthode est que le transgène s’intègre aléatoirement dans le génome de la souris. En revanche, le ciblage génétique permet aux scientifiques de « knock—out » un gène d’intérêt ou de faire une insertion – knock—in – à un site spécifique du génome de la souris. Le locus Rosa26 est un endroit utile pour insérer un gène, l’emplacement de l’insertion est connu — pas aléatoire — et il permet aux scientifiques d’étudier un gène sans affecter la fonction des autres gènes.

Les modèles Knock-in utilisant ce locus offrent une plus grande précision et reproductibilité des résultats. Traditionnellement, ces souris knock-in ont été générées à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris, et ce processus est devenu plus efficace avec l’avènement de la technologie CRISPR. Biocytogen utilise son système exclusif d’édition extrême du génome (EGE™) basé sur CRISPR/ Cas9 pour obtenir des résultats plus rapides en multipliant la recombinaison homologue de 10 à 20 fois.

Pourquoi Rosa26 est-Il utilisé?

En raison de sa facilité de frappe dans l’ADN, le locus Rosa26 sur le chromosome 6 de la souris est très utile pour les scientifiques. Parce que ce locus code un ARN non essentiel et non un gène qui remplit une fonction critique, les insertions n’ont pas d’effets indésirables. La nature stable du site et la capacité des scientifiques à contrôler l’expression génique globale ou conditionnelle font du modèle de souris Rosa26 un outil génétique polyvalent.

Lignées cellulaires d’étude

 lignées cellulaires d'étude

 étudier les lignées cellulaires

En ajoutant un gène rapporteur à ce locus, les chercheurs peuvent tracer des lignées cellulaires. La capacité de suivre les gènes tout au long d’une lignée permet une étude plus approfondie de la façon dont le code génétique se transmet et s’exprime au fil des générations.

En remplaçant le rapporteur par une toxine, les scientifiques peuvent abler les lignées cellulaires. Éliminer les gènes est une méthode utilisée pour étudier comment l’absence de certains gènes affectera un organisme. Une telle étude devient particulièrement utile pour identifier la fonction génique par son absence.

Étude de l’expression des gènes dans tout le corps

Le niveau élevé d’expression des gènes insérés dans le site Rosa26 le rend souhaitable pour les chercheurs. Une étude de 1997 sur des souris issues de cellules souches embryonnaires infectées par le rétrovirus ROSAßgeo a montré une expression dans tous les tissus du corps.

Analyse des chimères

L’analyse des chimères est une autre application de la souris Rosa26. De telles études examinent des souris de deux zygotes qui créent des animaux avec des génotypes différents dans leurs cellules. Certains animaux montrent des expressions de ces génotypes différents dans leur motif de fourrure ou leurs cellules.

Les souris Rosa26 expriment la β-galactosidase dans toutes leurs cellules. En tant que tels, les scientifiques peuvent utiliser des cellules Rosa26 comme allèles sauvages marqués. Le croisement de ces cellules avec des cellules mutantes marque ces cellules altérées. Ces marqueurs du site Rosa26 peuvent indiquer différents génotypes au sein d’une chimère.

Étudier les homozygotes Résultant d’un Knock-In

Alors que les souris avec des génotypes combinés s’avèrent utiles pour l’étude, les souris avec des génotypes singuliers provenant d’un knock-In dans un gène au site Rosa26 sont également bénéfiques. Dans les expériences utilisant ce locus, les homozygotes produits restent vivants, bien que peu nombreux. La viabilité de ces souris assure l’étude plus longue des résultats du gène ajouté à l’emplacement Rosa26.

Examiner la différenciation des cellules embryonnaires

En utilisant le site Rosa26, les scientifiques ont créé des lignées cellulaires stables comprenant la protéine kinase A, CA-PKA. Lorsque les cellules surexprimaient le PKA, elles présentaient une plus grande différenciation et une formation vasculaire. Les chercheurs ont postulé que l’insertion de gènes cibles sur le site Rosa26 leur permettrait de mieux étudier comment les cellules embryonnaires se transforment en cellules corporelles spécifiques.

Examiner les effets des gènes sur la maladie

 examiner les effets des gènes sur la maladie

 examiner les effets des gènes sur la maladie

L’une des raisons pour lesquelles les scientifiques mènent des études de synthèse Rosa26 est de voir comment un gène affecte le développement d’une maladie. Plusieurs maladies ont des liens génétiques suspects, et l’ajout ou la soustraction de ces gènes du génome peut déterminer si un gène individuel ou un groupe d’entre eux joue un rôle dans le développement de conditions telles que le diabète ou la maladie d’Alzheimer.Par exemple, les chercheurs ont utilisé des souris knock-in Rosa26 pour examiner comment les tyrosine kinases des récepteurs Met (RTK) ont affecté l’apparition de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette étude a révélé que l’augmentation de la RTK Met chez la souris n’avait pas d’effet sur le développement des motoneurones. Cependant, cela a ralenti la perte de motoneurones, retardé l’apparition de la SLA et prolongé la vie des souris atteintes de SLA.

Étude de la localisation chez diverses espèces

Un autre aspect utile de ce locus est sa présence chez différentes espèces. Bien que le locus Rosa26 ait été caractérisé à l’origine chez la souris, il est également présent chez l’homme, le porc, le rat, la souris et le lapin. En 2018, les chercheurs ont identifié avec succès le site Rosa26 chez les bovins. Pour prouver l’efficacité de Rosa26 comme refuge chez les bovins, les chercheurs ont inséré des gènes dans ce locus et ont produit une lignée cellulaire à utiliser dans de futures études.

Étude du locus Rosa26 chez l’homme

Alors que l’étude des insertions de gènes chez la souris pourrait aider les recherches futures en génétique humaine, l’utilisation de Rosa26 chez l’homme n’est pas encore possible. Contrairement à la localisation chez la souris, Rosa26 chez l’homme est proche des gènes critiques. L’édition génétique du locus Rosa26 chez l’homme pourrait donc perturber la fonction de ces autres gènes. Parce que l’impact de l’ajout de gènes à ce site chez l’homme pourrait avoir des impacts inconnus, Rosa26 peut ne pas être un site d’insertion sûr chez l’homme. Cependant, AAVS1 est un lieu refuge dans le génome humain.

Avantages supplémentaires des souris Knock-In Rosa26

Le locus Rosa26 offre plusieurs avantages par rapport aux autres emplacements du génome, ce qui en fait une option idéale pour l’insertion de gènes spécifiques au site.

Moins de souris nécessaires

Parce que les scientifiques connaissent le site spécifique d’insertion des gènes, ils ont besoin de moins de souris pour réussir. Le besoin de moins de souris réduit les ressources et le temps nécessaires, permettant d’autres études dans d’autres domaines.

Taux de réussite plus élevés

Chez les souris transgéniques, l’ADN est intégré de manière aléatoire dans le génome et le nombre de copies du transgène est variable. Lorsqu’ils ciblent le locus Rosa26, les scientifiques obtiennent des taux de succès plus élevés en raison de la localisation connue et d’une plus grande prévisibilité des résultats par rapport à la technologie transgene plus ancienne.

Emplacement stable

Les insertions génétiques ne peuvent être effectuées à aucune position du génome de la souris, car certaines localisations codent des protéines ayant des fonctions critiques. En revanche, le locus Rosa26 est un refuge qui ne perturbera pas la fonction génique. Par conséquent, l’insertion de gènes avec des mutations ou des reporters fluorescents au locus Rosa26 permet d’exprimer le nouveau gène sans interférence.

Reproductibilité des résultats

De nombreuses souris fondatrices (génération F0) sont produites lorsqu’un modèle transgénique est généré. Ces fondateurs, cependant, avaient des résultats génétiques différents, et ils étaient presque impossibles à reproduire. Une partie de ce problème concerne le nombre de copies transgéniques et les différences de loci dans chaque modèle. Pour Rosa26, les scientifiques ont un locus distinct qui leur permet, ainsi qu’à d’autres chercheurs, de reproduire les résultats expérimentaux.

Gène Cible Express Après Différenciation Cellulaire

 Gène Cible Express Après Différenciation Cellulaire

 Gène cible Express Après Différenciation cellulaire

Finalement, les cellules embryonnaires se différencieront en diverses cellules du corps qui formeront les tissus, le sang, les organes, les os et d’autres parties du corps. Lors de l’utilisation du site Rosa26 et de l’insertion d’un gène cible, l’expression résultante du gène apparaît dans les cellules après cet événement de différenciation.

Cette expression répandue explique pourquoi même les souris adultes issues de cette méthode d’édition génétique montrent encore les traits de la mutation. La capacité du gène à suivre divers changements cellulaires le rend idéal pour les scientifiques qui cherchent à examiner comment les cellules se modifient tout au long de la vie de l’organisme, du fœtus à l’adulte.

Comment Les Scientifiques Créent-Ils Des Souris Rosa26 KI?

L’insertion de gènes dans le locus Rosa26 peut être réalisée soit en utilisant des cellules souches embryonnaires ciblées, soit via le système CRISPR/Cas9. Une séquence floquée, qui contient souvent de la néomycine, est positionnée devant un gène d’intérêt pour l’empêcher de se transcrire et de s’exprimer par la suite.

Pour l’expression conditionnelle, les scientifiques utilisent le système Cre-lox. Le croisement d’une souris conditionnelle « floquée » avec une souris exprimant la recombinase Cre supprime les séquences d’ADN trouvées dans la séquence floquée. Sans le LoxP-3XSTOP-LoxP en amont du gène, le gène peut maintenant être transcrit. Jusqu’à ce que ce délétère Cre supprime la fonction stop, la cellule se comportera normalement sans exprimer le gène. En utilisant cette méthode conditionnelle, les scientifiques peuvent contrôler le moment où les gènes sont exprimés dans différentes cellules ou tissus.

Typiquement, la cassette insérée comprend également un rapporteur pour suivre l’expression du gène. Dans de nombreuses études sur ce locus, les scientifiques ont utilisé lacZ, un gène bactérien, comme rapporteur car, à moins d’être intégré dans des exons ou des introns, il ne produit pas d’expression. Lorsqu’il est autorisé à s’exprimer, le lacZ favorise l’expression de la β‐galactosidase dans tous les tissus adultes.

L’utilisation améliorée de la technologie CRISPR / Cas9 permet aux scientifiques d’utiliser également cette méthode pour frapper les gènes sur le site Rosa26. Par rapport aux anciens moyens d’injection de zygotes, CRISPR a créé des taux de succès plus élevés. Les méthodes plus anciennes ne donnaient que 10% à 20% de mutants fondateurs vivants, alors que les souris produites par CRISPR avaient un taux de réussite de 50% avec viabilité et mutation.

L’ARN CRISPR (ARNCR) et l’ARN TRACEUR (ARNTRR) se lient l’un à l’autre et à la séquence du gène cible. Le processus nécessite l’arNCR pour identifier l’ADN dans la séquence tandis que les protéines Cas9 ont besoin de l’ARNCTR pour leur activité.

Pour générer une souris knock-in via CRISPR, l’ARNCR, l’ARNTR, Cas9 et un vecteur de ciblage sont injectés dans le zygote de la souris. Les 2 ARN guident la nucléase Cas9 vers un site spécifique du génome (par exemple Rosa26), et Cas9 effectue la rupture à double brin. La cellule réparera l’ADN cassé par un processus appelé réparation dirigée par homologie (HDR). Les gènes d’intérêt au sein d’un vecteur de ciblage sont incorporés ou insérés dans le locus Rosa26. Le système EGE de Biocytogen accélère le HDR, réduisant ainsi le temps d’écran des souris F0.

Pour vérifier l’exactitude des résultats, l’analyse Southern blot constitue le moyen privilégié de dépistage des insertions aléatoires. Étant donné que le vecteur de ciblage peut produire des insertions aléatoires dans 32% des projets CRISPR, l’analyse Southern blot devient un outil essentiel pour tester les produits finis. Avec ce test, la position et le numéro de copie dans le gène sont vérifiés pour leur précision.

Pourquoi Utiliser des souris Rosa26 dans Vos Recherches ?

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