Rosa26 Knock-in-hiiren hyödyllisyys

mikä on Rosa 26 knock-in

mikä on Rosa 26 knock-in

rosa26-lokus hiiren genomissa on ”turvasatama”, jonka avulla tutkijat voivat ilmaista kiinnostavia geenejä. Eri geenien kohdentamistekniikoita (alkion kantasolut; CRISPR) käytetään tiettyjen DNA-insertioiden tekemiseen Rosa26-lokuksessa. Perustelut tutkijoiden käyttää Rosa26 ja muita keskeisiä etuja käyttämällä tällaista hiiren geneettinen malli keskustellaan.

mikä on Rosa26-lokus?

1990-luvun alussa tutkijat eristivät Rosa26: n, jolloin tutkijoille annettiin erityinen paikka geenien lisäämiseen tutkittavaksi. Tätä ennen geneetikot käyttivät siirtogeenisiä hiirimalleja hypoteesien testaamiseen. Siirtogeeniset hiiret syntyvät ruiskuttamalla plasmidi-DNA: ta pronukleukseen. Transgeneesin yksi rajoitus on, että plasmidi-DNA integroituu satunnaisesti hiiren genomiin.

tieteelliseltä nimeltään GtROSA26, tämä lokus löytyy hiirten kromosomista 6. Se koodaa epäolennaista RNA: ta, joka replikoituu koko kehoon ja jokaiseen sitä ilmaisevaan soluun/kudokseen kehossa. Siksi tämä lokus tarjoaa hyödyllisen paikan tehdä geenin insertioita ja tutkia, miten proteiinit vaikuttavat koko kehoon.

tutkijat loivat tämän linjan alun perin alkion kantasolujen retrovirusgeenin ansastuksen avulla. Tutkijat tunnistivat tätä sisältäneet alkion kantasolut proviraaliseksi kopioksi ja ruiskuttivat niitä blastokysteihin. Tutkijat erottelivat rosa26-lisäyksen saaneet hiiret tulevaa tutkimusta varten. Yhdelläkään solulla ei ollut vektori Gen–ROSAßgeo natiivisti, mikä vaati tutkijoita luomaan tarvittavat tyhjästä.

ennen geenien kohdentamista tutkijat loivat siirtogeenisiä hiiriä. Tämä tehtiin ruiskuttamalla plasmidi-DNA: ta eli transgeenia hiiren pronucleukseen. Yksi tämän menetelmän haittapuolista on se, että transgeeni integroituu satunnaisesti hiiren genomiin. Sen sijaan geenitavoitteen avulla tutkijat voivat joko ”tyrmätä” kiinnostavan geenin tai tehdä lisäyksen — knock-in — tiettyyn kohtaan hiiren genomissa. Rosa26-lokus on hyödyllinen paikka geenin lisäämiselle, lisäyksen sijainti tiedetään — ei sattumanvaraisesti — ja sen avulla tutkijat voivat tutkia geeniä vaikuttamatta muiden geenien toimintaan.

tätä lokusta käyttävät Knock-in-mallit tarjoavat paremman tarkkuuden ja toistettavuuden tuloksille. Perinteisesti nämä knock-in-hiiret on tuotettu käyttämällä hiiren alkion kantasoluja, ja tämä prosessi on tehostunut CRISPR-teknologian myötä. Biocytogen käyttää omaa CRISPR / Cas9-pohjaista Extreme Genome Editing (EGE™) – järjestelmäänsä saadakseen nopeampia tuloksia nostamalla homologisen rekombinaation 10-20-kertaiseksi.

Miksi Rosa26: Ta Käytetään?

koska Rosa26-lokus hiiren kromosomissa 6 on helppo koputtaa DNA: han, se on erittäin hyödyllinen tutkijoille. Koska tämä lokus koodaa ei-olennaista RNA: ta eikä kriittistä tehtävää palvelevaa geeniä, insertioilla ei ole haitallisia vaikutuksia. Sivuston vakaa luonne ja tutkijoiden kyky hallita globaalia tai ehdollista geeniekspressiota tekevät Rosa26-hiirimallista monipuolisen geneettisen työkalun.

tutkimuksen solulinjat

 tutkimuksen solulinjat

solulinjoja

lisäämällä tähän lokukseen reportterigeenin tutkijat voivat jäljittää solulinjoja. Kyky seurata geenejä läpi linjan mahdollistaa syvällisemmän tutkimuksen siitä, miten geneettinen koodi kulkee ja ilmaisee itseään sukupolvien aikana.

kun toimittaja korvataan myrkyllä, tutkijat voivat ablatoida solulinjoja. Geenien tyrmääminen on yksi menetelmä, jolla tutkitaan, miten tiettyjen geenien puuttuminen vaikuttaa eliöön. Tällainen tutkimus tulee erityisen hyödylliseksi geenin toiminnan tunnistamisessa sen puuttumisen kautta.

geenin ilmentymisen tutkiminen koko kehossa

Rosa26-kohtaan lisättyjen geenien suuri ilmentymistaso tekee siitä tutkijoille suotavaa. Vuonna 1997 tehdyssä tutkimuksessa hiirillä, jotka oli kasvatettu rosaßgeo retroviruksen infektoimista alkion kantasoluista, havaittiin ilmentymistä kaikissa kehon kudoksissa.

Chimera-analyysi

Chimera-analyysi on toinen rosa26-hiiren sovellus. Näissä tutkimuksissa tutkitaan hiiriä kahdesta tsygootista, jotka luovat eläimiä, joiden soluissa on erilaisia genotyyppejä. Joillakin eläimillä esiintyy näiden erilaisten genotyyppien ilmentymiä turkiskuvioissaan tai soluissaan.

Rosa26-hiiret ilmentävät β-galaktosidaasia koko soluissaan. Sellaisenaan tutkijat voivat käyttää Rosa26-soluja merkittyinä villeinä alleeleina. Risteytyminen mutanttisolujen kanssa merkitsee muuttuneita soluja. Nämä rosa26-alueen merkit voivat osoittaa Khimairan eri genotyyppejä.

tutkimus homotsygootit, jotka johtuvat Knock-in

vaikka hiiret, joilla on yhdistetyt genotyypit, osoittautuvat hyödyllisiksi tutkimuksessa, hiiret, joilla on yksiköllinen genotyyppi rosa26-kohdassa olevan geenin koputtamisesta, ovat myös hyödyllisiä. Tätä lokusta käyttävissä kokeissa tuotetut homotsygootit jäävät elämään, joskin niitä on vähän. Näiden hiirten elinkelpoisuus takaa lisätyn geenin tulosten pidemmän tutkimisen Rosa26-paikassa.

tutki alkion solujen erilaistumista

käyttämällä Rosa26-kohtaa tutkijat loivat stabiileja solulinjoja, joihin kuului proteiinikinaasi a, CA-PKA. Kun solut yliekspressoivat PKA: ta, niillä oli suurempi erilaistuminen ja verisuonten muodostuminen. Tutkijat esittivät, että lisäämällä kohdegeenejä Rosa26-kohtaan he voisivat paremmin tutkia, miten alkion solut muuttuvat tiettyihin kehon soluihin.

tutki geenien vaikutusta sairauteen

 tutki geenien vaikutusta sairauteen

tutki geenien vaikutusta sairauteen

yksi syy, miksi tutkijat tekevät Rosa26-knock – in-tutkimuksia, on selvittää, miten geeni vaikuttaa taudin kehittymiseen. Useat sairaudet ovat epäillyt geneettisiä yhteyksiä, ja lisäämällä tai vähentämällä nämä geenit genomista voidaan määrittää, jos yksittäinen geeni tai ryhmä niistä pelata roolia kehittämiseen sairauksia, kuten diabetes tai Alzheimerin. esimerkiksi tutkijat käyttivät Rosa26 knock-in hiirillä tutkia, miten met reseptorityrosiinikinaasien (RTK) vaikutti puhkeamista amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS). Tutkimuksessa havaittiin, että Met-RTK: n lisääminen hiirillä ei vaikuttanut motoneuronikehitykseen. Se kuitenkin hidasti motoneuronien katoamista, viivästytti ALS-taudin puhkeamista ja pidensi ALS-tautia sairastavien hiirten elämää.

sijainnin tutkiminen eri lajeilla

toinen hyödyllinen osa tätä lokusta on sen esiintyminen eri lajeissa. Vaikka Rosa26-lokus oli alun perin ominaista hiirille, sitä esiintyy myös ihmisillä, sioilla, rotilla, hiirillä ja kaneilla. Vuonna 2018 tutkijat onnistuivat tunnistamaan rosa26-alueen nautaeläimistä. Todistaakseen Rosa26: n tehon nautaeläinten turvasatamana tutkijat lisäsivät tähän lokukseen geenejä ja tuottivat solulinjan käytettäväksi tulevissa tutkimuksissa.

Rosa26-lokuksen tutkimus ihmisillä

vaikka geeninsiirrosten tutkiminen hiirillä voisi auttaa tulevaa ihmisgenetiikan tutkimusta, rosa26: n käyttö ihmisillä ei ole vielä mahdollista. Toisin kuin hiirillä, ihmisillä Rosa26 on lähellä kriittisiä geenejä. Rosa26-lokuksen muokkaaminen geeneillä ihmisillä voisi siis häiritä näiden muiden geenien toimintaa. Koska vaikutus lisäämällä geenien tässä kohdassa ihmisillä voi olla tuntemattomia vaikutuksia, Rosa26 ei ehkä ole turvallinen satama lisäys sivusto ihmisillä. Kuitenkin, AAVS1 on turvallinen satama lokus ihmisen perimässä.

Rosa26 Knock-in-hiirten lisäedut

Rosa26-lokus tarjoaa useita etuja muihin genomin kohtiin verrattuna, joten se on ihanteellinen vaihtoehto paikkasidonnaisen geenin lisäämiseen.

vähemmän hiiriä tarvitaan

koska tutkijat tietävät geenien asettamiskohdan, he tarvitsevat vähemmän hiiriä menestyäkseen. Hiirien vähenemisen tarve vähentää resursseja ja aikaa, mikä mahdollistaa jatko-opinnot muilla aloilla.

suuremmat onnistumisprosentit

siirtogeenisillä hiirillä DNA on satunnaisesti integroitunut genomiin ja transgeenin kopioluku on vaihteleva. Kun kohteena Rosa26 lokus, tutkijat saavuttavat korkeampia onnistumisprosentteja, koska tunnettu sijainti ja suurempi ennustettavuus tuloksia verrattuna vanhempaan transgene-teknologiaan.

stabiili sijainti

geneettisiä insertioita ei voi tehdä mihinkään kohtaan hiiren perimässä, sillä jotkin paikat koodaavat proteiineja, joilla on kriittisiä toimintoja. Sen sijaan Rosa26-lokus on turvasatama, joka ei häiritse geenien toimintaa. Siksi mutaatioita tai fluoresoivia reporttereita sisältävien geenien lisääminen Rosa26-lokukseen mahdollistaa uuden geenin ilmaisemisen ilman häiriöitä.

tulosten uusittavuus

Useita perustajahiiriä (F0-sukupolvi) syntyy, kun syntyy siirtogeenistä mallia. Näillä perustajilla oli kuitenkin erilaiset geneettiset tulokset, ja niiden lisääntyminen oli lähes mahdotonta. Osa tästä kysymyksestä liittyy transgene-kopionumeroon ja lokuseroihin kussakin mallissa. Rosa26: lle tutkijoilla on erillinen lokus, jonka avulla he ja muut tutkijat voivat toistaa kokeellisia tuloksia.

Express Target geeni solujen erilaistumisen jälkeen

 Express Target geeni solujen erilaistumisen jälkeen

ilmentävä Kohdegeeni solujen erilaistumisen jälkeen

lopulta alkiosolut erilaistuvat kehon eri soluiksi, joista muodostuu kudoksia, verta, elimiä, luita ja muita ruumiinosia. Kun käytetään Rosa26-kohtaa ja lisätään kohdegeeni, tuloksena oleva geenin ilmentymä näkyy soluissa tämän erilaistumistapahtuman jälkeen.

tämä laajalle levinnyt ilmaisu selittää, miksi jopa aikuiset hiiret tällä geenimuokkausmenetelmällä osoittavat edelleen mutaation piirteitä. Geenin kyky seurata läpi erilaisia solumuutoksia tekee siitä ihanteellisen tutkijoille, jotka haluavat tutkia, miten solut muuttuvat organismin elämän kautta sikiöstä aikuiseen.

miten tutkijat luovat Rosa26 KI-hiiriä?

geenien lisääminen Rosa26-lokukseen voidaan toteuttaa joko kohdistettujen alkion kantasolujen avulla tai CRISPR/Cas9-järjestelmän kautta. Floksoitu sekvenssi, joka sisältää usein neomysiiniä, asetetaan kiinnostavan geenin eteen estämään sitä transkriboimasta ja myöhemmin ilmentymästä.

ehdollisen ilmaisun osalta tutkijat käyttävät Cre-lox-järjestelmää. Ehdollisen ”floxed” – hiiren risteytäminen Cre-rekombinaasia ilmaisevan hiiren kanssa poistaa floxed-sekvenssin sisällä olevat DNA-sekvenssit. Ilman loxp-3xstop-LoxP yläjuoksulla geeni voidaan nyt transkriboida. Kunnes tämä Cre deleter poistaa pysäytystoiminnon, solu käyttäytyy normaalisti ilmentämättä geeniä. Käyttämällä tätä ehdollista knock-in-menetelmää tutkijat voivat valvoa, milloin geenit ilmaistaan eri soluissa tai kudoksissa.

tyypillisesti insertoidussa kasetissa on myös reportteri, joka seuraa geenin ilmentymistä. Monissa tämän lokuksen tutkimuksissa tutkijat ovat käyttäneet lacZ-bakteerin geeniä reportterina, koska jos se ei ole integroitu eksoneihin tai introneihin, se ei tuota ekspressiota. Kun lacZ saa ilmaista itseään, se edistää β-galaktosidaasin ilmentymistä jokaisessa aikuisen kudoksessa.

CRISPR/Cas9-tekniikan parempi käyttö mahdollistaa sen, että tutkijat voivat käyttää tätä menetelmää myös rosa26-kohdan geenien koputtamiseen. Verrattuna vanhempiin tsygoottien injektiovälineisiin CRISPR loi paremmat onnistumisprosentit. Vanhemmat menetelmät tuottivat vain 10-20% elävistä perustajamutanteista, kun taas CRISPR: n tuottamilla hiirillä oli 50% onnistumisprosentti elinkelpoisuuden ja mutaation kanssa.

CRISPR-RNA (crRNA) ja TRACER-RNA (tracrna) sitoutuvat molemmat toisiinsa ja kohdegeenisarjaan. Prosessi vaatii crRNA: ta tunnistamaan sekvenssin DNA: n, kun taas Cas9-proteiinit tarvitsevat tracrRNA: ta aktiivisuuteensa.

knock-in-hiiren tuottamiseksi CRISPR: n kautta hiiren tsygoottiin ruiskutetaan crRNA, tracrRNA, Cas9 ja kohdistusvektori. 2 RNAs ohjaa Cas9-nukleaasin tiettyyn kohtaan genomissa (esimerkiksi Rosa26), ja Cas9 tekee kaksoisjuosteen katkeamisen. Solu korjaa rikkinäisen DNA: n homology-directed repair (HDR) – nimisen prosessin avulla. Kohdevektorissa olevat kiinnostavat geenit liitetään tai lisätään Rosa26-lokukseen. Biocytogenen EGE-järjestelmä nopeuttaa HDR: ää, mikä lyhentää F0-hiirten seulontaaikaa.

tulosten oikeellisuuden varmistamiseksi Southern blot-analyysi tarjoaa ensisijaisen keinon seuloa satunnaisia lisäyksiä. Koska kohdistusvektori voi tuottaa satunnaisia lisäyksiä 32%: ssa CRISPR-projekteista, Southern blot-analyysistä tulee kriittinen työkalu lopputuotteiden testaamisessa. Tällä testillä geenin sijainti ja kopiointinumero tarkistetaan oikeaksi.

miksi käytät Rosa26-hiiriä tutkimuksessasi?

 rosa26-hiiret tutkimukseen

hiirten geenimalleja käyttäville tutkimuslaitoksille tulosten luotettavuus on ratkaisevassa asemassa päätettäessä, mistä eläimet saadaan. Tulosten todentaminen, pitkä menestys ja lukuisat tyytyväiset asiakkaat ovat merkkejä laadukkaasta lähteestä Rosa26-hiirille ja muille geneettisille palveluille.

Biocytogen voi tuottaa Rosa26-knock-in-hiiriä ja ehdollisia knock-in-hiiriä, jotka auttavat tutkijoita käsittelemään tieteellisiä kysymyksiä. Olemme palveluntarjoajia ja innovaattoreita. Meidän oma EGE menetelmä nopeuttaa HR nopeammin tuloksia tinkimättä tarkkuus. Mikään ydinlaitos tai myyjä ei ole tätä etua.

Biocytogen tarjoaa 100% tyytyväisyystakuun. Jos haluat lisätietoja räätälöidyistä ratkaisuistamme tai tiedustelut Rosa26 mice-luontiprosessistamme, ota meihin yhteyttä.

Jaa:

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.