La Utilidad del Ratón Rosa26 Knock-in

 qué es el rosa 26 knock-in

qué es el rosa 26 knock-in

El locus Rosa26 en el genoma del ratón es un «puerto seguro» que permite a los investigadores expresar genes de interés. Se utilizan diferentes tecnologías de selección de genes (células madre embrionarias; CRISPR) para realizar inserciones específicas de ADN en el locus Rosa26. Se discutirán las razones para que los científicos utilicen Rosa26 y otros beneficios clave para el uso de este tipo de modelo genético de ratón.

¿Qué es el Locus Rosa26?

A principios de la década de 1990, los investigadores aislaron Rosa26, dando a los científicos un sitio específico para insertar genes para estudiar. Antes de esto, los genetistas utilizaron modelos de ratones transgénicos para probar hipótesis. Los ratones transgénicos se generan inyectando ADN plásmido en un pronúcleo. Una limitación de la transgénesis es que el ADN plásmido se integra aleatoriamente en el genoma del ratón.

Científicamente denominado GtROSA26, este locus se encuentra en el cromosoma 6 de ratones. Codifica un ARN no esencial que se replica en todo el cuerpo y en cada célula/tejido del cuerpo que lo expresa. Por lo tanto, este lugar proporciona un lugar útil para hacer inserciones de genes y estudiar cómo las proteínas afectan a todo el cuerpo.

Los científicos crearon inicialmente esta línea a través de la captura de genes retrovirales de células madre embrionarias. Los científicos identificaron células madre embrionarias que contenían esto como una copia proviral y las inyectaron en blastocistos. Los investigadores separaron los ratones que tenían la inserción Rosa26 para un estudio futuro. Ninguna célula tenía el vector Gen–ROSAßgeo de forma nativa, lo que requería que los científicos crearan las necesarias desde cero.

Antes de la selección de genes, los investigadores crearon ratones transgénicos. Esto se logró inyectando ADN plásmido-transgeno-en el pronúcleo del ratón. Una desventaja de este método es que el transgén se integra aleatoriamente en el genoma del ratón. Por el contrario, la selección de genes permite a los científicos «eliminar» un gen de interés o realizar una inserción — knock-in — en un sitio específico en el genoma del ratón. El locus Rosa26 es un lugar útil para insertar un gen, la ubicación de la inserción es conocida, no aleatoria, y permite a los científicos estudiar un gen sin afectar la función de otros genes.

Los modelos Knock-in que utilizan este locus ofrecen una mayor precisión y reproducibilidad de los resultados. Tradicionalmente, estos ratones knock-in se generaban utilizando células madre embrionarias de ratón, y este proceso se ha vuelto más eficiente con el advenimiento de la tecnología CRISPR. Biocytogen utiliza su sistema patentado de Edición de Genoma Extremo (EGE™) basado en CRISPR/Cas9 para obtener resultados más rápidos al aumentar la recombinación homóloga de 10 a 20 veces.

¿Por Qué Se Utiliza Rosa26?

Debido a su facilidad para golpear el ADN, el locus Rosa26 en el cromosoma 6 de ratón es muy útil para los científicos. Debido a que este locus codifica un ARN no esencial y no un gen que cumple una función crítica, las inserciones carecen de efectos adversos. La naturaleza estable del sitio y la capacidad de los científicos para controlar la expresión génica global o condicional hacen del modelo de ratón Rosa26 una herramienta genética versátil.

Linajes celulares de estudio

 linajes celulares de estudio

estudiar linajes celulares

Al agregar un gen reportero a este locus, los investigadores pueden rastrear linajes celulares. La capacidad de seguir genes a lo largo de una línea permite un estudio más profundo de cómo el código genético se transmite y se expresa a través de generaciones.

Reemplazando el reportero con una toxina, los científicos pueden extirpar linajes celulares. Eliminar genes es un método utilizado para estudiar cómo la ausencia de ciertos genes afectará a un organismo. Tal estudio se vuelve especialmente útil para identificar la función génica a través de su ausencia.

Estudiar la Expresión Génica en todo el Cuerpo

El alto nivel de expresión de los genes insertados en el sitio Rosa26 lo hace deseable para los investigadores. Un estudio de 1997 de ratones cultivados a partir de células madre embrionarias infectadas con retrovirus ROSAßgeo mostró expresión en todos los tejidos del cuerpo.

Análisis de quimeras

El análisis de quimeras es otra aplicación del ratón Rosa26. Estos estudios examinan ratones de dos cigotos que crean animales con diferentes genotipos en sus células. Algunos animales muestran expresiones de esos genotipos diferentes en su patrón de pelaje o células.

Los ratones Rosa26 expresan β-galactosidasa a través de sus células. Como tal, los científicos pueden usar células Rosa26 como alelos silvestres marcados. Cruzar estas células con células mutantes marca las células alteradas. Estos marcadores del sitio Rosa26 pueden indicar diferentes genotipos dentro de una quimera.

Estudio De homocigotos Resultantes de Knock-In

Mientras que los ratones con genotipos combinados resultan útiles para el estudio, los ratones con genotipos singulares de knock-in de un gen en el sitio Rosa26 también son beneficiosos. En experimentos con este locus, los homocigotos producidos permanecen vivos, aunque pocos en número. La viabilidad de estos ratones asegura un estudio más largo de los resultados del gen añadido en la ubicación Rosa26.

Examinar la Diferenciación de Células Embrionarias

Utilizando el sitio Rosa26, los científicos crearon líneas celulares estables que incluían la proteína quinasa A, CA-PKA. Cuando las células sobreexpresaron la PKA, tuvieron mayor diferenciación y formación vascular. Los investigadores postularon que la inserción de genes diana en el sitio Rosa26 les permitiría estudiar mejor cómo las células embrionarias se transforman en células corporales específicas.

Examinar los efectos de los genes en la enfermedad

 examinar los efectos de los genes en la enfermedad

examinar los efectos de los genes en la enfermedad

Una de las razones por las que los científicos llevan a cabo estudios Rosa26 es para ver cómo un gen afecta el desarrollo de una enfermedad. Varias enfermedades tienen vínculos genéticos sospechosos, y la adición o sustracción de estos genes del genoma puede determinar si un gen individual o un grupo de ellos desempeñan un papel en el desarrollo de afecciones como la diabetes o el Alzheimer. Por ejemplo, los investigadores utilizaron ratones Rosa26 knock-in para examinar cómo afectaron las tirosinas cinasas (RTK) del receptor Met a la aparición de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Ese estudio encontró que el aumento de la RTK Met en ratones no tuvo un efecto en el desarrollo de la neurona motora. Sin embargo, ralentizó la pérdida de neuronas motoras, retrasó el inicio de la ELA y extendió la vida de los ratones con ELA.

Estudiar la Ubicación en Varias Especies

Otro aspecto útil de este lugar es su presencia en diferentes especies. Aunque el locus Rosa26 se caracterizó originalmente en ratones, también está presente en humanos, cerdos, ratas, ratones y conejos. En 2018, los investigadores identificaron con éxito el sitio Rosa26 en bovinos. Para probar la eficacia de Rosa26 como puerto seguro en bovinos, los investigadores insertaron genes en este locus y produjeron una línea celular para su uso en estudios futuros.

Estudio del Locus Rosa26 en humanos

Aunque el estudio de inserciones de genes en ratones podría ayudar a la futura investigación genética humana, el uso de Rosa26 en humanos aún no es posible. A diferencia de la ubicación en ratones, Rosa26 en humanos está cerca de genes críticos. La edición de genes en el locus Rosa26 en humanos podría, por lo tanto, interrumpir la función de estos otros genes. Debido a que el impacto de agregar genes en este sitio en humanos podría tener impactos desconocidos, Rosa26 puede no ser un sitio de inserción de puerto seguro en humanos. Sin embargo, el AAVS1 es un locus de puerto seguro en el genoma humano.

Beneficios adicionales de los ratones Knock-In Rosa26

El locus Rosa26 ofrece varios beneficios sobre otras ubicaciones del genoma, lo que lo convierte en una opción ideal para la inserción de genes específicos de un sitio.

Se necesitan menos ratones

Debido a que los científicos conocen el sitio específico para insertar genes, requieren menos ratones para tener éxito. La necesidad de menos ratones reduce los recursos y el tiempo necesarios, lo que permite realizar estudios adicionales en otras áreas.

Tasas de éxito más altas

En ratones transgénicos, el ADN se integra aleatoriamente en el genoma y el número de copias transgénicas es variable. Al apuntar al locus Rosa26, los científicos logran mayores tasas de éxito debido a la ubicación conocida y una mayor previsibilidad de los resultados en comparación con la tecnología transgénica más antigua.

Ubicación estable

Las inserciones genéticas no se pueden hacer en ninguna posición del genoma del ratón, ya que algunas ubicaciones codifican proteínas con funciones críticas. En contraste, el locus Rosa26 es un puerto seguro que no interrumpirá la función génica. Por lo tanto, la inserción de genes con mutaciones o reporteros fluorescentes en el locus Rosa26 permite que el nuevo gen se exprese sin interferencias.

Reproducibilidad de los resultados

Se producen numerosos ratones fundadores (generación F0) cuando se genera un modelo transgénico. Estos fundadores, sin embargo, tuvieron resultados genéticos diferentes, y eran casi imposibles de reproducir. Parte de este problema se relaciona con el número de copia transgénico y las diferencias de loci en cada modelo. Para Rosa26, los científicos tienen un locus distinto que les permite a ellos y a otros investigadores reproducir los resultados experimentales.

Gen Diana Expreso Después De la Diferenciación Celular

 Gen Diana Expreso Después De la Diferenciación Celular

Expresar el Gen Diana Después de la Diferenciación celular

Eventualmente, las células embrionarias se diferenciarán en varias células del cuerpo que formarán los tejidos, la sangre, los órganos, los huesos y otras partes del cuerpo. Al usar el sitio Rosa26 e insertar un gen diana, la expresión resultante del gen aparece en las células después de este evento de diferenciación.

Esta expresión generalizada explica por qué incluso los ratones adultos de este método de edición de genes aún muestran los rasgos de la mutación. La capacidad del gen para rastrear varios cambios celulares lo hace ideal para los científicos que buscan examinar cómo las células se alteran a lo largo de la vida del organismo, desde el feto hasta el adulto.

¿Cómo Crean Los Científicos Ratones Rosa26 KI?

La inserción de genes en el locus Rosa26 se puede lograr mediante el uso de células madre embrionarias dirigidas o a través del sistema CRISPR/Cas9. Un floxed secuencia, que a menudo contiene neomicina, se coloca delante de un gen de interés para evitar que se transcriban y posteriormente se expresan.

Para la expresión condicional, los científicos emplean el sistema Cre-lox. El cruce de un ratón «floxeado» condicional con un ratón que exprese la recombinasa Cre elimina las secuencias de ADN encontradas dentro de la secuencia floxeada. Sin el loxP-3XSTOP-loxP aguas arriba del gen, el gen ahora puede ser transcrito. Hasta que este deléter Cre elimine la función de parada, la célula se comportará normalmente sin expresar el gen. Usando este método de inserción condicional, los científicos pueden controlar cuándo los genes se expresan en diferentes células o tejidos.

Normalmente, el casete insertado también incluye un reportero para rastrear la expresión del gen. En muchos estudios de este locus, los científicos han utilizado LacZ, un gen bacteriano, como reportero porque a menos que se integre en exones o intrones, no produce expresión. Cuando se le permite expresarse, LacZ promueve la expresión de β‐galactosidasa en todos los tejidos adultos.

El uso mejorado de la tecnología CRISPR/Cas9 permite a los científicos utilizar también este método para golpear genes en el sitio Rosa26. En comparación con los métodos más antiguos de inyección de cigotos, CRISPR creó tasas más altas de éxito. Los métodos más antiguos solo produjeron entre el 10% y el 20% de los mutantes fundadores vivos, mientras que los ratones producidos por CRISPR tuvieron una tasa de éxito del 50% con viabilidad y mutación.

El ARN CRISPR (ARN CRR) y el ARN TRAZADOR (ARN TRACR) se unen entre sí y con la secuencia del gen diana. El proceso requiere de ARNr CR para identificar el ADN en la secuencia, mientras que las proteínas Cas9 necesitan ARNr Trac para su actividad.

Para generar un ratón knock-in a través de CRISPR, se inyectan crRNA, Tracrna, Cas9 y un vector de objetivo en el cigoto del ratón. Los 2 ARN guían a la nucleasa Cas9 a un sitio específico en el genoma (por ejemplo, Rosa26), y Cas9 hace que la doble cadena se rompa. La célula reparará el ADN roto a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés). Los genes de interés dentro de un vector objetivo se incorporan o insertan en el locus Rosa26. El sistema EGE de Biocytogen acelera el HDR, lo que reduce el tiempo de cribado de ratones F0.

Para verificar la precisión de los resultados, el análisis Southern blot proporciona el medio principal de detección de inserciones aleatorias. Debido a que el vector de segmentación puede producir inserciones aleatorias en el 32% de los proyectos CRISPR, el análisis Southern blot se convierte en una herramienta crítica para probar los productos terminados. Con esta prueba, se verifica la precisión de la posición y el número de copia en el gen.

¿Por qué Utilizar Ratones Rosa26 en Su Investigación?

ratones rosa26 para la investigación

Para las instituciones de investigación que utilizan modelos genéticos de ratón, la fiabilidad de los resultados juega un papel crucial en la decisión de dónde obtener los animales. La verificación de los resultados, un largo historial de éxitos y numerosos clientes satisfechos son signos de una fuente de calidad para ratones Rosa26 y otros servicios genéticos.

El biocytogen puede generar ratones knock-in y knock-in condicionales Rosa26 para ayudar a los investigadores a abordar cuestiones científicas. Somos proveedores de servicios e innovadores. Nuestro método EGE patentado acelera la frecuencia cardíaca para obtener resultados más rápidos sin sacrificar la precisión. Ninguna instalación principal o proveedor tiene esta ventaja.

Biocytogen ofrece una garantía de satisfacción del 100%. Para obtener más información sobre nuestras soluciones personalizadas o para consultas sobre nuestro proceso de creación de ratones Rosa26, contáctenos.

Compartir:

Deja una respuesta

Tu dirección de correo electrónico no será publicada.