Der Nutzen der Rosa26-Knock-In-Maus

Was ist das Rosa 26-Knock-In

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Der Rosa26-Locus im Mausgenom ist ein „sicherer Hafen“, der es Forschern ermöglicht, Gene von Interesse auszudrücken. Verschiedene Gen-Targeting-Technologien (embryonale Stammzellen; CRISPR) werden verwendet, um spezifische DNA-Insertionen am Rosa26-Locus durchzuführen. Die Gründe für die Verwendung von Rosa26 durch Wissenschaftler und andere wichtige Vorteile für die Verwendung dieser Art von mausgenetischem Modell werden diskutiert.

Was ist der Rosa26-Locus?

In den frühen 1990er Jahren isolierten Forscher Rosa26 und gaben Wissenschaftlern eine spezifische Stelle für das Einfügen von Genen zur Untersuchung. Zuvor verwendeten Genetiker transgene Mausmodelle, um Hypothesen zu testen. Transgene Mäuse werden durch Injektion von Plasmid-DNA in einen Vorkern erzeugt. Eine Einschränkung der Transgenese besteht darin, dass Plasmid-DNA zufällig in das Mausgenom integriert wird.

Wissenschaftlich als GtROSA26 bezeichnet, befindet sich dieser Locus auf Chromosom 6 von Mäusen. Es kodiert eine nicht essentielle RNA, die sich im ganzen Körper und in jeder Zelle / Gewebe im Körper, die sie exprimiert, repliziert. Daher bietet dieser Ort einen nützlichen Ort, um Geninsertionen vorzunehmen und zu untersuchen, wie sich Proteine auf den gesamten Körper auswirken.

Wissenschaftler schufen diese Linie zunächst durch retrovirales Gen-Trapping von embryonalen Stammzellen. Wissenschaftler identifizierten embryonale Stammzellen, die diese als provirale Kopie enthielten, und injizierten sie in Blastozysten. Die Forscher trennten die Mäuse, die die Rosa26-Insertion für zukünftige Studien hatten. Keine Zelle besaß den Vektor Gen–ROSAßgeo nativ, weshalb die Wissenschaftler die benötigten von Grund auf neu erstellen mussten.

Vor dem Gen-Targeting schufen Forscher transgene Mäuse. Dies wurde durch Injektion von Plasmid—DNA — Transgen – in den Mausvorkern erreicht. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass sich das Transgen zufällig in das Mausgenom integriert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Gen-Targeting Wissenschaftlern, entweder ein interessierendes Gen „auszuschalten“ oder eine Insertion — Knock-in — an einer bestimmten Stelle im Mausgenom vorzunehmen. Der Rosa26-Locus ist ein nützlicher Ort zum Einfügen eines Gens, Der Ort der Insertion ist bekannt — nicht zufällig — und ermöglicht es Wissenschaftlern, ein Gen zu untersuchen, ohne die Funktion anderer Gene zu beeinträchtigen.

Knock-In-Modelle mit diesem Locus bieten eine höhere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Traditionell wurden diese Knock-In-Mäuse mit embryonalen Stammzellen von Mäusen erzeugt, und dieser Prozess ist mit dem Aufkommen der CRISPR-Technologie effizienter geworden. Biocytogen verwendet sein proprietäres CRISPR / Cas9-basiertes Extreme Genome Editing (EGE ™) -System, um schnellere Ergebnisse zu erzielen, indem die homologe Rekombination um das 10- bis 20-fache erhöht wird.

Warum wird Rosa26 verwendet?

Aufgrund seiner einfachen Integration in die DNA ist der Rosa26-Locus auf Mauschromosom 6 für Wissenschaftler sehr nützlich. Da dieser Locus eine nicht essentielle RNA und kein Gen kodiert, das eine kritische Funktion erfüllt, fehlen Insertionen nachteilige Auswirkungen. Die stabile Natur der Stelle und die Fähigkeit der Wissenschaftler, die globale oder bedingte Genexpression zu kontrollieren, machen das Rosa26-Mausmodell zu einem vielseitigen genetischen Werkzeug.

Zelllinien studieren

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Durch Hinzufügen eines Reportergens zu diesem Locus können Forscher Zelllinien verfolgen. Die Fähigkeit, Genen in einer Linie zu folgen, ermöglicht eine eingehendere Untersuchung, wie genetischer Code über Generationen weitergegeben und ausgedrückt wird.

Durch den Ersatz des Reporters durch ein Toxin können Wissenschaftler Zelllinien abtragen. Das Ausschlagen von Genen ist eine Methode, um zu untersuchen, wie sich das Fehlen bestimmter Gene auf einen Organismus auswirkt. Eine solche Studie wird besonders nützlich, um die Genfunktion durch ihre Abwesenheit zu identifizieren.

Untersuchung der Genexpression im gesamten Körper

Die hohe Expression von Genen, die in die Rosa26-Stelle eingefügt werden, macht es für Forscher wünschenswert. Eine Studie von 1997 an Mäusen, die aus embryonalen Stammzellen gezüchtet wurden, die mit dem ROSAßgeo-Retrovirus infiziert waren, zeigte eine Expression in jedem Gewebe des Körpers.

Chimäre Analyse

Chimäre Analyse ist eine weitere Anwendung der Rosa26 Maus. Solche Studien untersuchen Mäuse aus zwei Zygoten, die Tiere mit unterschiedlichen Genotypen in ihren Zellen erzeugen. Einige Tiere zeigen Ausdrücke dieser unterschiedlichen Genotypen in ihrem Fellmuster oder ihren Zellen.

Rosa26-Mäuse exprimieren β-Galactosidase in ihren Zellen. So können Wissenschaftler Rosa26-Zellen als markierte Wildallele verwenden. Die Kreuzung dieser Zellen mit mutierten Zellen markiert diese veränderten Zellen. Diese Marker von der Rosa26-Stelle können verschiedene Genotypen innerhalb einer Chimäre anzeigen.

Homozygoten aus Knock-In untersuchen

Während sich Mäuse mit kombinierten Genotypen für Studien als nützlich erweisen, sind Mäuse mit singulären Genotypen aus Knock-In einem Gen an der Rosa26-Stelle ebenfalls von Vorteil. In Experimenten mit diesem Locus bleiben die produzierten Homozygoten am Leben, wenn auch nur wenige. Die Lebensfähigkeit dieser Mäuse gewährleistet die längere Untersuchung der Ergebnisse des hinzugefügten Gens am Rosa26-Standort.

Untersuchung der embryonalen Zelldifferenzierung

Unter Verwendung der Rosa26-Site erstellten Wissenschaftler stabile Zelllinien, die Proteinkinase A, CA-PKA, enthielten. Wenn Zellen PKA überexprimierten, hatten sie eine größere Differenzierung und Gefäßbildung. Die Forscher postulierten, dass das Einfügen von Zielgenen an der Rosa26-Stelle es ihnen ermöglichen würde, besser zu untersuchen, wie sich embryonale Zellen in spezifische Körperzellen verwandeln.

Untersuchen Sie die Auswirkungen von Genen auf Krankheiten

Untersuchen Sie die Auswirkungen von Genen auf Krankheiten

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Ein Grund, warum Wissenschaftler Rosa26-Knock-In-Studien durchführen, ist zu sehen, wie ein Gen die Entwicklung einer Krankheit beeinflusst. Mehrere Krankheiten haben genetische Verbindungen vermutet, und das Hinzufügen oder Subtrahieren dieser Gene aus dem Genom kann bestimmen, ob ein einzelnes Gen oder eine Gruppe von ihnen eine Rolle bei der Entwicklung von Erkrankungen wie Diabetes oder Alzheimer spielt. Zum Beispiel verwendeten Forscher Rosa26-Knock-in-Mäuse, um zu untersuchen, wie Met-Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) den Beginn der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) beeinflussten. Diese Studie ergab, dass die Erhöhung der Met-RTK bei Mäusen keinen Einfluss auf die Entwicklung von Motoneuronen hatte. Es verlangsamte jedoch den Verlust von Motoneuronen, verzögerte den Ausbruch von ALS und verlängerte das Leben von Mäusen mit ALS.

Untersuchung des Ortes bei verschiedenen Arten

Ein weiterer nützlicher Aspekt dieses Ortes ist seine Anwesenheit bei verschiedenen Arten. Obwohl der Rosa26-Locus ursprünglich bei Mäusen charakterisiert wurde, ist er auch bei Menschen, Schweinen, Ratten, Mäusen und Kaninchen vorhanden. Im Jahr 2018 identifizierten Forscher erfolgreich die Rosa26-Stelle bei Rindern. Um die Wirksamkeit von Rosa26 als sicherer Hafen bei Rindern nachzuweisen, fügten die Forscher Gene in diesen Locus ein und produzierten eine Zelllinie für zukünftige Studien.

Untersuchung des Rosa26-Locus beim Menschen

Während die Untersuchung von Geninsertionen bei Mäusen die zukünftige humangenetische Forschung unterstützen könnte, ist die Verwendung von Rosa26 beim Menschen noch nicht möglich. Im Gegensatz zur Lokalisation bei Mäusen befindet sich Rosa26 beim Menschen in der Nähe kritischer Gene. Die Genbearbeitung des Rosa26-Locus beim Menschen könnte daher die Funktion dieser anderen Gene stören. Da die Auswirkungen des Hinzufügens von Genen an dieser Stelle beim Menschen unbekannte Auswirkungen haben könnten, ist Rosa26 möglicherweise keine sichere Einfügestelle beim Menschen. AAVS1 ist jedoch ein sicherer Hafen im menschlichen Genom.

Zusätzliche Vorteile von Rosa26 Knock-In-Mäusen

Der Rosa26-Locus bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Stellen im Genom und ist somit eine ideale Option für die ortsspezifische Geninsertion.

Weniger Mäuse benötigt

Da Wissenschaftler die spezifische Stelle zum Einfügen von Genen kennen, benötigen sie weniger Mäuse für den Erfolg. Der Bedarf an weniger Mäusen reduziert den Ressourcen- und Zeitaufwand und ermöglicht weitere Studien in anderen Bereichen.

Höhere Erfolgsraten

Bei transgenen Mäusen wird DNA zufällig in das Genom integriert und die Anzahl der Transgenkopien ist variabel. Beim Targeting des Rosa26-Locus erzielen Wissenschaftler aufgrund des bekannten Ortes und der besseren Vorhersagbarkeit der Ergebnisse im Vergleich zu älteren Transgen-Technologien höhere Erfolgsraten.

Stabile Position

Genetische Insertionen können an keiner Position im Mausgenom vorgenommen werden, da einige Stellen Proteine mit kritischen Funktionen kodieren. Im Gegensatz dazu ist der Rosa26-Locus ein sicherer Hafen, der die Genfunktion nicht stört. Daher ermöglicht das Einfügen von Genen mit Mutationen oder fluoreszierenden Reportern am Rosa26-Locus die interferenzfreie Expression des neuen Gens.

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

Bei der Generierung eines transgenen Modells werden zahlreiche Founder (F0 Generation) Mäuse produziert. Diese Gründer hatten jedoch unterschiedliche genetische Ergebnisse und waren fast unmöglich zu reproduzieren. Ein Teil dieses Problems bezieht sich auf die transgene Kopienzahl und Loci Unterschiede in jedem Modell. Für Rosa26 haben Wissenschaftler einen eindeutigen Ort, der es ihnen und anderen Forschern ermöglicht, experimentelle Ergebnisse zu reproduzieren.

Zielgen nach Zelldifferenzierung exprimieren

Zielgen nach Zelldifferenzierung exprimieren

 Zielgen nach Zelldifferenzierung exprimieren

Schließlich differenzieren sich embryonale Zellen in verschiedene Körperzellen, die Gewebe, Blut, Organe, Knochen und andere Körperteile bilden. Bei Verwendung der Rosa26-Stelle und Insertion eines Zielgens erscheint die resultierende Expression des Gens in den Zellen nach diesem Differenzierungsereignis.

Diese weit verbreitete Expression erklärt, warum selbst erwachsene Mäuse aus dieser Methode der Genbearbeitung immer noch die Merkmale der Mutation zeigen. Die Fähigkeit des Gens, verschiedene Zellveränderungen zu verfolgen, macht es ideal für Wissenschaftler, die untersuchen möchten, wie sich Zellen im Laufe des Lebens des Organismus vom Fötus bis zum Erwachsenen verändern.

Wie erzeugen Wissenschaftler Rosa26 KI-Mäuse?

Das Einfügen von Genen in den Rosa26-Locus kann entweder durch gezielte embryonale Stammzellen oder über das CRISPR / Cas9-System erfolgen. Eine floxierte Sequenz, die häufig Neomycin enthält, wird vor einem interessierenden Gen positioniert, um zu verhindern, dass es transkribiert und anschließend exprimiert.

Für den bedingten Ausdruck verwenden Wissenschaftler das Cre-lox-System. Die Kreuzung einer bedingten „floxierten“ Maus mit einer Maus, die Cre-Rekombinase exprimiert, löscht DNA-Sequenzen, die innerhalb der floxierten Sequenz gefunden wurden. Ohne das loxP-3XSTOP-loxP stromaufwärts des Gens kann das Gen nun transkribiert werden. Bis dieser Cre-Deleter die Stoppfunktion entfernt, verhält sich die Zelle normal, ohne das Gen zu exprimieren. Mit dieser bedingten Knock-In-Methode können Wissenschaftler steuern, wann Gene in verschiedenen Zellen oder Geweben exprimiert werden.

Typischerweise enthält die eingelegte Kassette auch einen Reporter, um die Expression des Gens zu verfolgen. In vielen Studien zu diesem Ort haben Wissenschaftler lacZ, ein bakterielles Gen, als Reporter verwendet, da es keine Expression erzeugt, wenn es nicht in Exons oder Introns integriert ist. Wenn lacZ sich selbst ausdrücken darf, fördert es die β-Galactosidase-Expression in jedem adulten Gewebe.

Der verbesserte Einsatz der CRISPR / Cas9-Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, diese Methode auch zum Einschleusen von Genen an der Rosa26-Stelle einzusetzen. Im Vergleich zu älteren Methoden zur Injektion von Zygoten erzielte CRISPR höhere Erfolgsraten. Ältere Methoden ergaben nur 10% bis 20% der lebenden Gründermutanten, während CRISPR-produzierte Mäuse eine Erfolgsrate von 50% mit Lebensfähigkeit und Mutation aufwiesen.

CRISPR-RNA (crRNA) und TRACER-RNA (tracrRNA) binden beide miteinander und mit der Zielgensequenz. Der Prozess erfordert crRNA, um die DNA in der Sequenz zu identifizieren, während Cas9-Proteine tracrRNA für ihre Aktivität benötigen.

Um eine Knock-In-Maus durch CRISPR zu erzeugen, werden crRNA, tracrRNA, Cas9 und ein Targeting-Vektor in die Mauszygote injiziert. Die 2 RNAs führen die Cas9-Nuklease zu einer bestimmten Stelle im Genom (z. B. Rosa26), und Cas9 lässt den Doppelstrang brechen. Die Zelle repariert die gebrochene DNA durch einen Prozess namens homologiegesteuerte Reparatur (HDR). Gene von Interesse innerhalb eines Zielvektors werden in den Rosa26-Locus eingebaut oder eingefügt. Das EGE-System von Biocytogen beschleunigt HDR und verkürzt somit die Zeit bis zum Screenen von F0-Mäusen.

Um die Genauigkeit der Ergebnisse zu überprüfen, bietet die Southern-Blot-Analyse das beste Mittel zum Screening auf zufällige Insertionen. Da der Targeting-Vektor in 32% der CRISPR-Projekte zufällige Insertionen erzeugen kann, wird die Southern-Blot-Analyse zu einem kritischen Werkzeug beim Testen der fertigen Produkte. Mit diesem Test werden die Position und die Kopienzahl im Gen auf Genauigkeit überprüft.

Warum Rosa26-Mäuse in Ihrer Forschung verwenden?

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Für Forschungseinrichtungen, die mausgenetische Modelle verwenden, spielt die Zuverlässigkeit der Ergebnisse eine entscheidende Rolle bei der Entscheidung, woher die Tiere stammen. Die Verifizierung der Ergebnisse, eine lange Erfolgsbilanz und zahlreiche zufriedene Kunden sind Anzeichen für eine Qualitätsquelle für Rosa26-Mäuse und andere genetische Dienstleistungen.

Biozytogen kann Rosa26-Knock-In- und bedingte Knock-In-Mäuse erzeugen, um Forschern bei der Beantwortung wissenschaftlicher Fragen zu helfen. Wir sind Dienstleister und Innovatoren. Unsere proprietäre EGE-Methode beschleunigt HR für schnellere Ergebnisse ohne Einbußen bei der Genauigkeit. Kein Core Facility oder Vendor hat diesen Vorteil.

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