nytten af Rosa26 Knock-in musen

hvad er rosa 26 knock-in

hvad er rosa 26 knock-in

Rosa26 locus i musgenomet er en “sikker havn”, som gør det muligt for forskere at udtrykke gener af interesse. Forskellige genmålretningsteknologier (embryonale stamceller; CRISPR) bruges til at foretage specifikke DNA-indsættelser på Rosa26 locus. Begrundelsen for forskere til at bruge Rosa26 og andre vigtige fordele ved at bruge denne type musens genetiske model vil blive diskuteret.

Hvad er Rosa26 Locus?

i begyndelsen af 1990 ‘ erne isolerede forskere Rosa26, hvilket gav forskere et specifikt sted til indsættelse af gener til undersøgelse. Før dette brugte genetikere transgene musemodeller til at teste hypoteser. Transgene mus genereres ved at injicere plasmid DNA i en pronucleus. En begrænsning af transgenese er, at plasmid-DNA tilfældigt integreres i musens genom.

videnskabeligt benævnt GtROSA26, findes dette locus på kromosom 6 af mus. Det koder for et ikke-essentielt RNA, der replikerer i hele kroppen og hver celle/væv i kroppen, der udtrykker det. Derfor giver dette locus et nyttigt sted til fremstilling af genindsættelser og undersøgelse af, hvordan proteiner påvirker hele kroppen.

forskere skabte oprindeligt denne linje gennem embryonal stamcelle retroviral Genfangst. Forskere identificerede embryonale stamceller, der indeholdt dette som en proviral kopi og injicerede dem i blastocyster. Forskere adskilt musene, der havde rosa26-indsættelsen til fremtidig undersøgelse. Ingen celler havde vektoren Gen-Rosa Largeo indbygget, hvilket krævede, at forskere skabte dem, der var nødvendige fra bunden.

før genmålretning skabte forskere transgene mus. Dette blev opnået ved at injicere plasmid DNA — transgen — i musens pronucleus. En ulempe ved denne metode er, at transgen tilfældigt integreres i musens genom. I modsætning hertil giver genmålretning forskere mulighed for enten at “knockout” et gen af interesse eller foretage en indsættelse — knock-in — på et specifikt sted i musens genom. Rosa26 locus er et nyttigt sted til indsættelse af et gen, placeringen af indsættelsen er kendt — ikke tilfældig — og det giver forskere mulighed for at studere et gen uden at påvirke funktionen af andre gener.

Knock-in-modeller, der bruger dette locus, giver større nøjagtighed og reproducerbarhed af resultater. Traditionelt blev disse knock-in mus genereret ved hjælp af musembryonale stamceller, og denne proces er blevet mere effektiv med fremkomsten af CRISPR-teknologi. Biocytogen bruger sit proprietære CRISPR / Cas9-baserede ekstreme Genomredigeringssystem (ege lart) for at opnå hurtigere resultater ved at øge den homologe rekombination 10 til 20 gange.

Hvorfor Anvendes Rosa26?

på grund af sin lette at banke i DNA er Rosa26 locus på musekromosomet 6 meget nyttigt for forskere. Fordi dette locus koder for et ikke-essentielt RNA og ikke et gen, der tjener en kritisk funktion, mangler indsættelser bivirkninger. Stedets stabile karakter og forskernes evne til at kontrollere global eller betinget genekspression gør rosa26-musemodellen til et alsidigt genetisk værktøj.

studie cellelinier

studie cellelinier

Undersøg cellelinjer

ved at tilføje et reportergen til dette locus kan forskere spore cellelinier. Evnen til at følge gener gennem en linje giver mulighed for en mere grundig undersøgelse af, hvordan genetisk kode passerer ned og udtrykker sig gennem generationer.

udskiftning af reporteren med et toksin, forskere kan ablate cellelinjer. At slå gener ud er en metode, der bruges til at undersøge, hvordan fraværet af visse gener vil påvirke en organisme. En sådan undersøgelse bliver særlig nyttig til identifikation af genfunktion gennem dets fravær.

undersøgelse af genekspression i hele kroppen

det høje niveau af ekspression af gener indsat i Rosa26-stedet gør det ønskeligt for forskere. En undersøgelse fra 1997 af mus, der er dyrket fra embryonale stamceller inficeret med Rosa Reloggeo retrovirus, viste ekspression i hvert væv i kroppen.

Chimera analyse

Chimera analyse er en anden anvendelse af rosa26 musen. Sådanne undersøgelser undersøger mus fra to gygoter, der skaber dyr med forskellige genotyper i deres celler. Nogle dyr viser udtryk for de forskellige genotyper i deres pelsmønster eller celler.

Rosa26-mus udtrykker kurr-galactosidase gennem deres celler. Som sådan kan forskere bruge Rosa26-celler som markerede vilde alleler. Krydsning af disse celler med mutante celler markerer de ændrede celler. Disse markører fra Rosa26-stedet kan indikere forskellige genotyper inden for en kimær.

Undersøg Homosygoter som følge af Knock-in

mens mus med kombinerede genotyper viser sig nyttige til undersøgelse, er mus med entalgenotyper fra at banke et gen på Rosa26-stedet også gavnlige. I eksperimenter, der bruger dette locus, producerede homosygoter forbliver i live, dog få i antal. Levedygtigheden af disse mus sikrer den længere undersøgelse af resultaterne af det tilsatte gen på Rosa26-lokationen.

Undersøg embryonal celledifferentiering

ved hjælp af Rosa26-stedet skabte forskere stabile cellelinjer, der omfattede proteinkinase a, CA-PKA. Når celler overudtrykt PKA, havde de større differentiering og vaskulær dannelse. Forskerne hævdede, at indsættelse af målgener på Rosa26-stedet ville give dem mulighed for bedre at undersøge, hvordan embryonale celler ændres til specifikke kropsceller.

Undersøg virkningerne af gener på sygdom

 Undersøg virkningerne af gener på sygdom

Undersøg virkningerne af gener på sygdom

en af grundene til, at forskere udfører Rosa26 knock-in-undersøgelser, er at se, hvordan et gen påvirker udviklingen af en sygdom. Flere sygdomme har mistanke om genetiske forbindelser, og tilføjelse eller subtrahering af disse gener fra genomet kan bestemme, om et individuelt gen eller en gruppe af dem spiller roller i udviklingen af tilstande som diabetes eller diabetes. for eksempel brugte forskere Rosa26 knock-in mus til at undersøge, hvordan Met-receptortyrosinkinaser (RTK) påvirkede starten på amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Denne undersøgelse viste, at forøgelse af Met RTK hos mus ikke havde nogen effekt på motorneuronudvikling. Det forsinkede imidlertid tabet af motorneuroner, forsinkede als-indtræden og forlængede musens liv med ALS.

undersøgelse af placeringen i forskellige arter

et andet nyttigt aspekt af dette locus er dets tilstedeværelse i forskellige arter. Selvom Rosa26 locus oprindeligt var karakteriseret hos mus, er den også til stede hos mennesker, svin, rotter, mus og kaniner. I 2018 identificerede forskere med succes Rosa26-stedet i kvæg. For at bevise effektiviteten af Rosa26 som en sikker havn hos kvæg indsatte forskere gener i dette locus og producerede en cellelinie til brug i fremtidige undersøgelser.

undersøgelse af Rosa26 Locus hos mennesker

mens undersøgelse af genindsættelser i mus kunne hjælpe fremtidig human genetik forskning, er brugen af Rosa26 hos mennesker endnu ikke mulig. I modsætning til placeringen hos mus er Rosa26 hos mennesker tæt på kritiske gener. Genredigering af Rosa26 locus hos mennesker kunne derfor forstyrre funktionen af disse andre gener. Da virkningen af at tilføje gener på dette sted hos mennesker kunne have ukendte virkninger, er Rosa26 muligvis ikke et sikkert havneindsættelsessted hos mennesker. AAVS1 er imidlertid et sikkert havnelokus i det menneskelige genom.

yderligere fordele ved Rosa26 Knock-in Mus

Rosa26 locus tilbyder flere fordele i forhold til andre steder på genomet, hvilket gør det til en ideel mulighed for stedsspecifik genindsættelse.

færre mus nødvendige

fordi forskere kender det specifikke sted for indsættelse af gener, kræver de færre mus for succes. Behovet for færre mus reducerer de nødvendige ressourcer og tid, hvilket muliggør yderligere undersøgelser på andre områder.

højere succesrate

i transgene mus integreres DNA tilfældigt i genomet, og transgenkopieringsnummeret er variabelt. Når man målretter mod Rosa26-locus, opnår forskere højere succesrate på grund af den kendte placering og større forudsigelighed af resultater sammenlignet med ældre transgenteknologi.

stabil placering

genetiske indsættelser kan ikke foretages på nogen position i musegenomet, da nogle placeringer koder for proteiner med kritiske funktioner. I modsætning hertil er Rosa26 locus en sikker havn, der ikke forstyrrer genfunktionen. Derfor indsætter gener med mutationer eller fluorescerende journalister på Rosa26 locus, at det nye gen kan udtrykkes uden indblanding.

reproducerbarhed af resultater

talrige grundlægger (F0 generation) mus produceres, når en transgen model genereres. Disse grundlæggere havde dog forskellige genetiske resultater, og de var næsten umulige at reproducere. En del af dette problem vedrører transgen kopi nummer og loci forskelle i hver model. For Rosa26 har forskere et særskilt locus, der giver dem og andre forskere mulighed for at reproducere eksperimentelle resultater.

Ekspres Målgen efter celledifferentiering

 Ekspres Målgen efter celledifferentiering

Ekspres Målgen efter celledifferentiering

til sidst vil embryonale celler differentiere sig i forskellige kropsceller, der vil danne væv, blod, organer, knogler og andre dele af kroppen. Når man bruger Rosa26-stedet og indsætter et målgen, vises den resulterende ekspression af genet i cellerne efter denne differentieringshændelse.

dette udbredte udtryk forklarer, hvorfor selv voksne mus fra denne metode til genredigering stadig viser træk ved mutationen. Genets evne til at spore gennem forskellige celleændringer gør det ideelt for forskere, der ønsker at undersøge, hvordan celler ændrer sig gennem organismens liv fra Foster til voksen.

hvordan skaber forskere Rosa26 Ki-mus?

indsættelse af gener i Rosa26 locus kan opnås enten ved hjælp af målrettede embryonale stamceller eller via CRISPR/Cas9-systemet. En flokset sekvens, som ofte indeholder neomycin, er placeret foran et gen af interesse for at forhindre, at det transkriberer og efterfølgende udtrykker.

til betinget udtryk anvender forskere Cre-loksystemet. Krydsning af en betinget” flokset ” mus med en mus, der udtrykker Cre-rekombinase, sletter DNA-sekvenser, der findes i den floksede sekvens. Uden Losp-3-stop-Losp opstrøms for genet kan genet nu transkriberes. Indtil denne Cre deleter fjerner stopfunktionen, opfører cellen sig normalt uden at udtrykke genet. Ved hjælp af denne betingede knock-in-metode kan forskere kontrollere, hvornår gener udtrykkes i forskellige celler eller væv.

typisk inkluderer den indsatte kassette også en reporter til at spore genets ekspression. I mange undersøgelser af dette sted har forskere brugt lacs, et bakteriegen, som reporter, fordi det, medmindre det er integreret i eksoner eller introner, ikke producerer udtryk. Når den får lov til at udtrykke sig, fremmer lacs ekspressionen af Kurt‐galactosidase i hvert voksent væv.

forbedret brug af CRISPR/Cas9-teknologi giver forskere mulighed for også at bruge denne metode til at banke gener på Rosa26-stedet. Sammenlignet med ældre midler til injektion af gygoter skabte CRISPR højere succesrate. Ældre metoder gav kun 10% til 20% af levende grundlæggermutanter, mens CRISPR-producerede mus havde en succesrate på 50% med levedygtighed og mutation.

CRISPR RNA (crRNA) og TRACER RNA (tracrRNA) binder begge sammen med hinanden og med målgensekvensen. Processen kræver, at crRNA identificerer DNA ‘ et i sekvensen, mens Cas9-proteiner har brug for tracrRNA for deres aktivitet.

for at generere en knock-in mus gennem CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 og en målretningsvektor injiceres i musygoten. De 2 RNA ‘ er leder Cas9-nukleasen til et specifikt sted i genomet (f.eks. Rosa26), og Cas9 får dobbeltstrenget til at bryde. Cellen vil reparere det ødelagte DNA gennem en proces kaldet homology-directed repair (HDR). Gener af interesse inden for en målretningsvektor bliver inkorporeret eller indsat i Rosa26 locus. Biocytogens EGE-system fremskynder HDR og reducerer derfor tiden til at screene F0-mus.

for at verificere nøjagtigheden af resultaterne giver Southern blot analysis det primære middel til screening for tilfældige indsættelser. Fordi målretningsvektoren kan producere tilfældige indsættelser i 32% af CRISPR-projekter, bliver Southern blot-analyse et kritisk værktøj til test af de færdige produkter. Med denne test bliver position og kopi nummer i genet verificeret for nøjagtighed.

Hvorfor bruge Rosa26 mus i din forskning?

rosa26 mus til forskning

for forskningsinstitutioner, der bruger musegenetiske modeller, spiller resultaternes pålidelighed en afgørende rolle i beslutningen om, hvor dyrene skal hentes. Verifikation af resultater, en lang rekord af succeser og mange tilfredse kunder er tegn på en kvalitetskilde for Rosa26 mus og andre genetiske tjenester.

Biocytogen kan generere Rosa26 knock-in og betingede knock-in mus for at hjælpe forskere med at løse videnskabelige spørgsmål. Vi er serviceudbydere og innovatører. Vores proprietære Ege-metode fremskynder HR for hurtigere resultater uden at ofre nøjagtigheden. Ingen kernefacilitet eller leverandør har denne fordel.

Biocytogen tilbyder en 100% tilfredshedsgaranti. For mere information om vores tilpassede løsninger eller for forespørgsler til vores rosa26 mus oprettelsesproces, kontakt os.

del:

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.