užitečnost Rosa26 Knock-in myši

co je rosa 26 knock-in

co je rosa 26 knock-in

lokus Rosa26 v myším genomu je „bezpečným přístavem“, který umožňuje vědcům vyjádřit zajímavé geny. Různé technologie cílení genů (embryonální kmenové buňky; CRISPR) se používají k provádění specifických inzercí DNA v lokusu Rosa26. Budou diskutovány důvody, proč vědci používají Rosa26 a další klíčové výhody používání tohoto typu myšího genetického modelu.

co je lokus Rosa26?

na počátku 90. let vědci izolovali Rosa26, což vědcům poskytlo specifické místo pro vkládání genů ke studiu. Předtím genetici používali transgenní myší modely k testování hypotéz. Transgenní myši jsou generovány injekcí plazmidové DNA do pronukleu. Jedním z omezení transgeneze je, že plazmidová DNA se náhodně integruje do myšího genomu.

vědecky označovaný jako GtROSA26 se tento lokus nachází na chromozomu 6 myší. Kóduje neesenciální RNA, která se replikuje v celém těle a každou buňku / tkáň v těle, která ji vyjadřuje. Proto tento lokus poskytuje užitečné místo pro vytváření genových inzercí a studium toho, jak proteiny ovlivňují celé tělo.

vědci původně vytvořili tuto linii pomocí retrovirového genu embryonálních kmenových buněk. Vědci identifikovali embryonální kmenové buňky, které to obsahovaly jako provirovou kopii, a injikovali je do blastocyst. Vědci oddělili myši, které měly vložení Rosa26 pro budoucí studium. Žádné buňky neměly vektorový Gen-ROSAßgeo nativně, což vyžadovalo, aby vědci vytvořili ty potřebné od nuly.

před cílením genů vědci vytvořili transgenní myši. Toho bylo dosaženo injekcí plazmidové DNA-transgen – do myšího pronukleu. Jednou z nevýhod této metody je, že transgen se náhodně integruje do genomu myši. Naproti tomu cílení genů umožňuje vědcům buď „vyřadit“ gen, který je předmětem zájmu, nebo provést vložení — knock-in — na určité místo v genomu myši. Lokus Rosa26 je užitečným místem pro vložení genu, umístění vložení je známo-ne náhodné — a umožňuje vědcům studovat Gen bez ovlivnění funkce jiných genů.

Knock-in modely používající tento lokus nabízejí větší přesnost a reprodukovatelnost výsledků. Tradičně byly tyto knock-in myši generovány pomocí myších embryonálních kmenových buněk a tento proces se stal účinnějším s příchodem technologie CRISPR. Biocytogen používá svůj patentovaný systém pro úpravu extrémních genomů založený na CRISPR/Cas9 (EGE™), aby získal rychlejší výsledky zvýšením homologní rekombinace 10 až 20krát.

Proč Se Přípravek Rosa26 Používá?

díky snadnému klepání v DNA je lokus Rosa26 na myším chromozomu 6 pro vědce velmi užitečný. Protože tento lokus kóduje neesenciální RNA a ne gen, který slouží kritické funkci, inzerce nemá nepříznivé účinky. Stabilní povaha místa a schopnost vědců řídit globální nebo podmíněnou genovou expresi činí z myšího modelu Rosa26 všestranný genetický nástroj.

studijní buněčné linie

studijní buněčné linie

studujte buněčné linie

přidáním reportérového genu do tohoto lokusu mohou vědci sledovat buněčné linie. Schopnost sledovat geny v celé linii umožňuje podrobnější studium toho, jak genetický kód prochází a vyjadřuje se po generace.

nahrazením reportéra toxinem mohou vědci ablaci buněčných linií. Vyřazení genů je jednou z metod používaných ke studiu toho, jak nepřítomnost určitých genů ovlivní organismus. Taková studie se stává zvláště užitečná při identifikaci genové funkce prostřednictvím její nepřítomnosti.

studium genové exprese v celém těle

vysoká úroveň exprese genů vložených do místa Rosa26 je pro výzkumníky žádoucí. Studie myší vypěstovaných z embryonálních kmenových buněk infikovaných retrovirem ROSAßgeo z roku 1997 ukázala expresi v každé tkáni v těle.

Chimérová analýza

chimérová analýza je další aplikací myši Rosa26. Takové studie zkoumají myši ze dvou zygotů, které ve svých buňkách vytvářejí zvířata s různými genotypy. Některá zvířata vykazují výrazy těchto odlišných genotypů v jejich kožešinovém vzoru nebo buňkách.

myši Rosa26 exprimují β-galaktosidázu v rámci svých buněk. Jako takový mohou vědci použít buňky Rosa26 jako označené divoké alely. Křížení těchto buněk s mutantními buňkami označuje tyto změněné buňky. Tyto markery z místa Rosa26 mohou naznačovat různé genotypy v chiméře.

studie homozygoti vyplývající z Knock-In

zatímco myši s kombinovanými genotypy se ukázaly jako užitečné pro studium, myši s singulárními genotypy z klepání v genu v místě Rosa26 jsou také prospěšné. V experimentech s použitím tohoto lokusu, produkované homozygoty zůstávají naživu, i když jen málo. Životaschopnost těchto myší zajišťuje delší studium výsledků přidaného genu v místě Rosa26.

Prozkoumejte diferenciaci embryonálních buněk

pomocí místa Rosa26 vědci vytvořili stabilní buněčné linie, které obsahovaly protein kinázu a, CA-PKA. Když buňky nadměrně exprimovaly PKA, měly větší diferenciaci a vaskulární tvorbu. Vědci předpokládali, že vložení cílových genů do místa Rosa26 jim umožní lépe studovat, jak se embryonální buňky mění na specifické tělesné buňky.

zkoumat účinky genů na nemoci

 zkoumat účinky genů na nemoci

zkoumejte účinky genů na onemocnění

jedním z důvodů, proč vědci provádějí studie Rosa26 knock-in, je zjistit, jak Gen ovlivňuje vývoj nemoci. Několik nemocí má podezření na genetické vazby a přidání nebo odečtení těchto genů z genomu může určit, zda jednotlivý gen nebo skupina z nich hraje roli ve vývoji stavů, jako je diabetes nebo Alzheimerova choroba. například vědci použili knock-in myši Rosa26 ke zkoumání toho, jak tyrosinkinázy receptoru Met (RTK) ovlivnily nástup amyotrofické laterální sklerózy (ALS). Tato studie zjistila, že zvýšení met RTK u myší nemělo vliv na vývoj motorických neuronů. Zpomalil však ztrátu motorických neuronů, zpozdil nástup ALS a prodloužil život myší s ALS.

studium umístění u různých druhů

dalším užitečným aspektem tohoto lokusu je jeho přítomnost u různých druhů. Ačkoli lokus Rosa26 byl původně charakterizován u myší, je také přítomen u lidí, prasat, potkanů, myší a králíků. V roce 2018 vědci úspěšně identifikovali místo Rosa26 u skotu. Aby dokázali účinnost Rosa26 jako bezpečného přístavu u skotu, vědci vložili geny do tohoto lokusu a vytvořili buněčnou linii pro použití v budoucích studiích.

studie lokusu Rosa26 u lidí

zatímco studium genových inzercí u myší by mohlo pomoci budoucímu výzkumu lidské genetiky, použití Rosa26 u lidí ještě není možné. Na rozdíl od umístění u myší je Rosa26 u lidí blízká kritickým genům. Genová editace lokusu Rosa26 u lidí by proto mohla narušit funkci těchto dalších genů. Protože dopad přidávání genů na tomto místě u lidí by mohl mít neznámé dopady, Rosa26 nemusí být bezpečným místem pro vložení přístavu u lidí. AAVS1 je však bezpečným přístavním místem v lidském genomu.

další výhody Knock-In myší Rosa26

lokus Rosa26 nabízí několik výhod oproti jiným místům v genomu, což z něj činí ideální volbu pro site-specific vložení genu.

méně myší potřebných

protože vědci znají specifické místo pro vkládání genů, vyžadují pro úspěch méně myší. Potřeba méně myší snižuje potřebné zdroje a čas, což umožňuje další studie v jiných oblastech.

vyšší míra úspěšnosti

u transgenních myší je DNA náhodně integrována do genomu a číslo transgenové kopie je variabilní. Při cílení na lokus Rosa26 dosahují vědci vyšší míry úspěchu díky známé poloze a větší předvídatelnosti výsledků ve srovnání se starší transgenovou technologií.

stabilní umístění

genetické vložení nelze provést v žádné poloze v genomu myši, protože některá místa kódují proteiny s kritickými funkcemi. Naproti tomu lokus Rosa26 je bezpečným přístavem, který nenaruší funkci genu. Proto vložení genů s mutacemi nebo fluorescenčními reportéry do lokusu Rosa26 umožňuje, aby byl nový gen exprimován bez interference.

reprodukovatelnost výsledků

četné myši zakladatele (generace F0) jsou produkovány při generování transgenního modelu. Tito zakladatelé, ačkoli, měli různé genetické výsledky, a bylo téměř nemožné je reprodukovat. Část tohoto problému se týká čísel transgenních kopií a rozdílů loci v každém modelu. Pro Rosa26 mají vědci zřetelné místo, které jim a dalším výzkumníkům umožňuje reprodukovat experimentální výsledky.

Expresní cílový Gen po diferenciaci buněk

 Expresní cílový Gen po diferenciaci buněk

Expresní cílový Gen po diferenciaci buněk

nakonec se embryonální buňky diferencují na různé tělesné buňky, které budou tvořit tkáně, krev, orgány, kosti a další části těla. Při použití místa Rosa26 a vložení cílového genu se výsledná exprese genu objeví v buňkách po této diferenciační události.

tento rozšířený výraz vysvětluje, proč i dospělé myši z této metody úpravy genů stále vykazují rysy mutace. Schopnost genu sledovat různé buněčné změny je ideální pro vědce, kteří chtějí zkoumat, jak se buňky mění v průběhu života organismu od plodu k dospělému.

jak vědci vytvářejí myši Rosa26 KI?

vložení genů do lokusu Rosa26 lze provést buď pomocí cílených embryonálních kmenových buněk nebo prostřednictvím systému CRISPR/Cas9. Floxovaná sekvence, která často obsahuje neomycin, je umístěna před genem, který je předmětem zájmu, aby se zabránilo jeho transkripci a následné expresi.

pro podmíněné vyjádření používají vědci systém Cre-lox. Křížení podmíněné „floxované“ myši s myší exprimující Rekombinázou Cre odstraní sekvence DNA nalezené v floxované sekvenci. Bez LoxP-3XSTOP-LoxP před genem lze Gen nyní transkribovat. Dokud tento Cre deleter neodstraní funkci stop, buňka se bude chovat normálně bez exprese genu. Pomocí této podmíněné metody knock-in mohou vědci kontrolovat, kdy jsou geny exprimovány v různých buňkách nebo tkáních.

vložená kazeta obvykle obsahuje také reportér pro sledování exprese genu. V mnoha studiích tohoto lokusu vědci použili lacZ, bakteriální gen, jako reportér, protože pokud není integrován do exonů nebo intronů, neprodukuje expresi. Když se lacZ nechá vyjádřit, podporuje expresi β-galaktosidázy v každé dospělé tkáni.

vylepšené využití technologie CRISPR / Cas9 umožňuje vědcům také použít tuto metodu pro klepání genů v místě Rosa26. Ve srovnání se staršími prostředky vstřikování zygotů vytvořil CRISPR vyšší míru úspěchu. Starší metody přinesly pouze 10% až 20% živých zakladatelských mutantů, zatímco myši produkované CRISPR měly 50% úspěšnost s životaschopností a mutací.

CRISPR RNA (crRNA) a TRACER RNA (tracrRNA) se navzájem váží a s cílovou genovou sekvencí. Proces vyžaduje crRNA k identifikaci DNA v sekvenci, zatímco proteiny Cas9 potřebují tracrRNA pro svou aktivitu.

pro generování knock-in myši přes CRISPR, crRNA, tracrRNA, Cas9 a cílení vektor jsou injikovány do myší zygoty. 2 RNA vedou nukleázu Cas9 na specifické místo v genomu (např. Buňka opraví zlomenou DNA procesem zvaným homologicky zaměřená Oprava (HDR). Geny zájmu v cílovém vektoru se začleňují nebo vkládají do lokusu Rosa26. Systém ege biocytogenu urychluje HDR, a proto zkracuje čas na obrazovku myší F0.

pro ověření přesnosti výsledků poskytuje Southern blot analysis Hlavní prostředky screeningu náhodných inzercí. Protože cílový vektor může produkovat náhodné vložení do 32% projektů CRISPR, analýza Southern blot se stává kritickým nástrojem při testování hotových výrobků. Tímto testem se ověřuje přesnost polohy a čísla kopie v genu.

Proč používat Rosa26 myši ve vašem výzkumu?

myši rosa26 pro výzkum

u výzkumných institucí, které používají myší genetické modely, hraje spolehlivost výsledků klíčovou roli při rozhodování o tom, kde zvířata získat. Ověření výsledků, dlouhý záznam úspěchů a řada spokojených zákazníků jsou známkou kvalitního zdroje pro myši Rosa26 a další genetické služby.

Biocytogen může generovat rosa26 knock-in a podmíněné knock-in myši, které pomáhají vědcům řešit vědecké otázky. Jsme poskytovatelé služeb a inovátoři. Naše patentovaná metoda EGE urychluje HR pro rychlejší výsledky bez ztráty přesnosti. Žádné základní zařízení nebo prodejce nemá tuto výhodu.

Biocytogen nabízí 100% záruku spokojenosti. Pro více informací o našich přizpůsobených řešeních nebo pro dotazy týkající se našeho procesu vytváření mice Rosa26 nás kontaktujte.

sdílet:

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.